Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований

Наличие вируса в аллантоисной и амниотической жидкостях зараженного эмбриона определяют с помощью реакции гемагглютинации. Жидкости эмбрионов с положительным результатом гемагглютинации после проверки на стерильность соединяют и титруют в развернутой реакции гемагглютинации.

При наличии небольшого количества вируса или невозможности выявить его в исследуемом материале проводят последовательные пассажи на куриных эмбрионах. Если после трех последующих пассажей на эмбрионах в исследуемом материале вирус не обнаруживают, результат считается отрицательным.

Культивирование клеток вне организма требует выполнения ряда условий. Одним из них является строгое соблюдение стерильности при работе, так как используемые питательные среды служат отличным питательным субстратом также для бактерий и грибов. Клетки тканей обладают весьма высокой чувствительностью к солям тяжелых металлов. Поэтому необходимо придавать исключительное значение качеству различных ингредиентов, входящих в состав солевых растворов и питательных сред, а также способам обработки посуды и резиновых пробок, применяемых при культивировании клеток.

Одним из обязательных условий успешной работы с клетками является высокое качество дистиллированной воды (проверяется два раза в неделю). Для работы с клетками используют бидистиллированную или деионизированную воду. Лучшими дистилляторами являются приборы из стекла или легированной стали. Из такой аппаратуры не вымываются ионы тяжелых металлов, являющихся токсичными для клеток. Деионизированную воду получают на специальных установках, где очистка воды от солей осуществляется при ее последовательном прохождении через колонки с анионитом и катионитом.

При культивировании клеток особенно большие требования предъявляются к подготовке и стерилизации посуды и пробок. Во многих случаях именно неправильные их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой дегенерации клеточного монослоя.

Для роста и размножения клеток вне организма необходим сложный комплекс физико-химических факторов: определенная температура, концентрация водородных ионов, неорганические соединения, углеводы, аминокислоты, белки, витамины, кислород и углекислота, поэтому для культивирования вирусов в культурах клеток используют сложные по составу питательные среды. По характеру компонентов, входящих в их состав, эти среды делят на две группы.

1. Среды, представляющие собой смеси солевых растворов (Хенкса, Эрла и др.) и естественных компонентов (сыворотка крови животных и человека, гидролизат альбумина). Количество каждого из этих компонентов в разных прописях сред различно.

2. Синтетические и полусинтетические среды, состоящие из солевых растворов (Эрла, Хенкса и др.) с добавлением аминокислот, витаминов, коэнзимов и нуклеотидов (среды Игла, 199 и др.). В синтетических средах клетки могут существовать в жизнеспособном состоянии непродолжительное время (до 7 дней). Для более длительного поддержания их в жизнеспособном состоянии, а также для создания лучших условий роста и размножения клеток к синтетическим средам добавляют сыворотку крови животных (коров, телят и др.).

Для выделения вирусов могут быть использованы разные методы культивирования клеток вне организма. Однако в настоящее время наибольшее практическое применение получил метод с использованием однослойных культур первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоскостенных сосудах-матрацах вместимостью 1 л, 250 и 100 мл или в обычных бактериологических пробирках, обработанных соответствующим способом.

Сущность метода с использованием первично-трипсинизированных культур клеток заключается в разрушении межклеточных связей в тканях протеолитическими ферментами и разобщении клеток для выращивания монослоя на поверхности стекла. Источником получения клеток могут служить ткани и органы эмбрионов человека и животных, забитых животных и птиц, а также извлеченные у человека при операции. Используют нормальные и злокачественные ткани, эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Способность к размножению клеток, извлеченных из организма, тесно связана со степенью дифференциации ткани. Чем меньше дифференцирована ткань, тем более интенсивной способностью пролиферации обладают ее клетки in vitro. Поэтому клетки эмбриональных и опухолевых тканей значительно легче культивировать вне организма, чем нормальные клетки взрослых животных.

Таблица 6

Наиболее употребляемые культуры перевиваемых клеток

Культуры ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера их роста. Если клетки не пролиферируют, выглядят округлыми, зернистыми, темными и отслаиваются от стекла, значит посуда плохо обработана или токсичны ингредиенты питательной среды.

Наряду с первично-трипсинизированными тканями для культивирования вирусов широко используют культуры перевиваемых клеток, т. е. культуры клеток, способных к размножению вне организма неопределенно длительное время. Наиболее часто применяют культуры клеток, полученные из нормальных и раковых тканей человека. Широкую известность приобрели линия клеток HeLa, полученная из опухоли шейки матки, Нер-2 – из карциономы гортани, КВ – из ткани рака полости рта. Готовят также культуры клеток и из нормальных тканей животных – почки обезьяны, кролика и эмбриона свиньи (табл. 6).

Для пересева перевиваемых клеток питательную среду отсасывают пипеткой и выливают. Сформировавшийся тонкий слой разрушают раствором трипсина, и освобожденные таким образом клетки переносят в новый сосуд со свежим питательным раствором, где вновь образуется монослой клеток.

Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток могут служить: а) развитие специфической дегенерации клеток; б) обнаружение внутриклеточных включений; в) обнаружение специфического антигена методом иммунофлюоресценции; г) положительная реакция гемадсорбции; д) положительная реакция гемагглютинации; е) образование бляшек.

Рис. 30. Внутриклеточные включения вируса в культуре клеток – тельца Гуарниери (по: Бургасов П. Н. и Николаевский Г. Р., 1972)

Для выявления специфической дегенерации в зараженных культурах клетки ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа. Многие вирусы при размножении в клетках вызывают их дегенерацию, т. е. оказывают цитопатическое действие (ЦПД).

Время развития и характер цитопатических изменений в инфицированных культурах клеток определяются свойствами и дозой инокулированного вируса, а также свойствами и условиями культивирования клеток. Одни вирусы (оспы, полиомиелита, Коксаки В и др.) вызывают ЦПД в пределах первой недели после заражения, другие (аденовирусы, парагриппозные вирусы, ЕСНО и др.) – спустя 1 – 2 нед. после заражения.

Вирусы вызывают цитопатические изменения трех основных типов: образование многоядерных гигантских клеток и симпластов, являющихся результатом слияния цитоплазмы многих клеток; круглоклеточную дегенерацию, возникающую вследствие утраты межклеточных связей и округления клеток; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток.

При размножении некоторых вирусов в культурах клеток образуются внутриклеточные включения в цитоплазме или ядре пораженных клеток (рис. 30). Культуры клеток для выявления включений выращивают на стеклянных пластинках в пробирках, заражают вирусом и через определенные сроки инкубации готовят препараты, окрашивая их обычными красителями.

Для выявления специфического антигена в зараженных культурах клеток препараты готовят так же, как для выявления включений, используя МФА.

В основе метода бляшек лежит образование в монослое зараженных вирусом клеток под агаровым покрытием обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных (погибших) клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующиеся, как правило, из одной вирусной частицы.

При отсутствии цитопатических изменений, внутриклеточных включений, бляшкообразования, отрицательных реакций гемадсорбции и гемагглютинации в культурах клеток, зараженных исследуемым материалом, проводят два последующих пассажа. При отсутствии указанных изменений в конечном пассаже результат выделения вируса считают отрицательным.

6.8. Обнаружение и идентификация вирусов

Для обнаружения вирусов в инфекционном материале могут быть использованы микроскопические и иммунологические методы.

К микроскопическим относятся вирусоскопия и обнаружение внутриклеточных включений; к иммунологическим – иммунная электронная микроскопия, иммунофлюоресценция, гемагглютинация, гемадсорбция.

Идентификация вирусов осуществляется с помощью иммунологических методов, включающих следующие реакции: а) торможение гемагглютинации; б) задержку гемадсорбции; в) связывание комплемента; г) нейтрализацию; д) преципитацию в геле агара.

Микроскопические методы. С помощью светового микроскопа могут быть обнаружены только крупные вирусы, размеры которых превышают 150 нм. Распознавание вирусов, имеющих меньшие размеры, возможно лишь в электронном микроскопе. Для выявления крупных вирусов может применяться световая, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия.

При вирусных инфекциях в зараженных клетках развиваются своеобразные включения. Одни инфекции (бешенство, оспенная вакцина) сопровождаются образованием включений в цитоплазме пораженных клеток, другие (корь, натуральная и ветряная оспа, аденовирусные заболевания) – в цитоплазме и ядре. Включения имеют различную природу, структуру, форму и размеры от 0,25 до 25 мкм. Согласно современным данным, при одних инфекциях включения являются местом размножения вируса и представляют собой его скопления, окруженные веществами клетки, при других – продукт дегенерации клетки.

Включения могут быть выявлены в окрашенных отпечатках органов и тканей, соскобах клеток, гистологических срезах из пораженной ткани и препаратах культур клеток, инфицированных вирусом. Окраску чаще производят по методу Романовского – Гимзы. Для окраски этим методом препараты фиксируют в смеси Дюбоска – Бразиля – Буэна, состоящей из пикриновой кислоты, формалина, спирта, уксусной кислоты. Внутриклеточные включения при большинстве вирусных инфекций являются оксифильными и красятся по методу Романовского – Гимзы в розовый или сиреневый цвет.

Иммунологические методы. В последние годы эти методы стали ведущими в лабораторной диагностике вирусных инфекций. Это во многом объясняется экономическими причинами, поскольку классические методы вирусологического анализа довольно дороги. Кроме того, длительность исследований с помощью вирусологических методов (недели), даже если они оказываются вполне эффективными, делают их ретроспективными.

Иммунологические методы используют как для обнаружения вирусных антигенов в различных биосубстратах и объектах внешней среды, так и для серодиагностики – выявления в сыворотках крови больных людей и лабораторных животных антител к вирусным антигенам. Помимо этого иммунологические методы исследования незаменимы при идентификации вирионов.

Взаимодействуя с организмом, вирусы вызывают образование антител, которые, адсорбируясь на вирионах, препятствуют проникновению вирионов в клетки и развитию цитопатического действия (ЦПД); нейтрализуют смертельное действие вирусов при репродукции их в куриных эмбрионах и организме животных; инактивируют вирионные гемагглютинины и нейраминидазы, предотвращая реакцию гемагглютинации (РГА) и реакцию гемадсорбции (РГадс) на пораженных вирусом клетках. Эти вируснейтрализующие антитела вызывают также агглютинацию и преципитацию вирусных частиц, а образующиеся при этом иммунные комплексы связывают комплемент. Поэтому для идентификации вирионов используются классическая реакция нейтрализации (РН) на культурах клеток, куриных эмбрионах и животных и ее модификации: реакция торможения гемагглютинации (РТГА); реакция торможения гемадсорбции (РТГадс). Те же реакции используются в серодиагностике вирусных инфекций для обнаружения в сыворотке больных вируснейтрализующих антител по известному вирусному антигену (диагностикуму).

Метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ). Электронная микроскопия в настоящее время играет важную роль в изучении вирусов. Именно данные электронной микроскопии служат основой современной классификации вирусов.

Новый этап в развитии электронно-микроскопического изучения вирусов – применение техники иммуноэлектронной микроскопии. С помощью этого метода стали возможными не только прямое обнаружение вирусов, но и их идентификация, а также быстрое серотипирование вирусных штаммов и титрование антител к ним. Большое значение ИЭМ приобрела для определения локализации вирусных антигенов внутри клеток макроорганизма.

Несомненным преимуществом ИЭМ является ее высокая чувствительность по сравнению с другими электронно-микроскопическими методами.

При контакте антигена вируса или вирусного компонента с гомологичной антисывороткой формируется комплекс антитело – антиген. Данный феномен является основой методики, употребляемой для обнаружения и идентификации вирусных антигенов или антител к ним. Именно эти комплексы антигенов с антителами после негативного контрастирования можно наблюдать в электронном микроскопе. В клинической диагностике антигенный материал не требует тщательной очистки. Так, в случае выявления вируса гриппа можно исследовать неочищенную аллантоисную жидкость. В настоящее время считается, что практически любой вид клинического материала пригоден для ИЭМ. В диагностических целях можно применять обычную нефракционированную сыворотку, а также сыворотки реконвалесцентов. На конечные результаты большое влияние оказывает соотношение количеств антигена и антител. При избытке антигена наблюдают изобилие частиц; агломераты в данном случае будут немногочисленны. При избытке антител вирусные частицы окружены их толстым слоем, выявить мелкие структурные детали вириона практически невозможно; агрегаты также немногочисленны. При оптимальном соотношении количеств антигена и антител агрегаты укрупняются при хорошем изображении деталей вирионов. В связи с вышеизложенным желательно использовать иммунную сыворотку в нескольких разведениях.

На опорную сетку наносят пленку-подложку, приготовленную из палладия. При использовании низких концентраций палладия и для улучшения адсорбционных свойств подложки ее укрепляют с помощью угля. Для этого на готовую сухую пленку-подложку на электронно-микроскопической сетке напыляют уголь в вакууме. Толщина пленки-подложки и укрепляющего слоя углерода оказывает существенное влияние на изображение мелких деталей объекта. Конкретную толщину пленок-подложек и слоя угля каждый исследователь определяет индивидуально, исходя из того, что углерод более электронно прозрачен, чем палладий.

Вирусы и антитела к ним имеют малую электронную плотность, поэтому биологические объекты невозможно выявлять с помощью электронного микроскопа без предварительной обработки. Для визуализации вирусов используется техника негативного контрастирования (или негативной окраски). Для негативного контрастирования вирусов и комплексов «вирус – антитело» применяют различные соли тяжелых металлов. Контрастирующие вещества (атомы тяжелых металлов) проникают в гидрофильные участки объектов и замещают в них воду. В результате электронная плотность объекта возрастает, становится возможным его наблюдение в электронном микроскопе.

Прямой метод ИЭМ получил наибольшее применение в практике. Вирусную суспензию смешивают с неразведенной антисывороткой. После энергичного перемешивания смесь инкубируют в течение 1 ч при температуре 37 °C, затем в течение ночи – при 4 °C. На следующий день смесь центрифугируют для осаждения иммунных комплексов. Осадок ресуспендируют в капле дистиллированной воды и подвергают негативному контрастированию.

При оценке результатов ИЭМ продукты взаимодействия между антигеном и антителом в электронном микроскопе могут иметь различный вид (отдельной вирусной частицы, покрытой антителами полностью или частично; агломератов вирусных частиц). Агломераты могут занимать различную площадь, иметь различный внешний вид, содержать различное количество частиц. Поэтому, наряду с опытными, необходимо исследовать контрольные препараты (с буферным раствором или гетерологичной антисывороткой).

Критерий оценки результатов, полученных с помощью ИЭМ, – наличие или отсутствие в препаратах скоплений вирусных частиц, агрегированных иммунной сывороткой. Наличие агломератов антигена и антител специфической антисыворотки – признак положительной реакции. Тем не менее следует учитывать возможность неспецифической агрегации частиц антигена под влиянием высокоскоростного центрифугирования. По этой причине многие авторы рекомендуют учитывать результаты по условной шкале от 0 до 4 +. Она основана на оценке степени покрытия агрегированных частиц антителами сыворотки.

Методы гемагглютинации и гемадсорбции. Многие вирусы обладают способностью агглютинировать (склеивать) эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека; вирус клещевого энцефалита – эритроциты барана; вирусы японского энцефалита – эритроциты однодневных цыплят и гусей; аденовирусы – эритроциты крыс, мышей, обезьян. В качестве исследуемого материала в реакции гемагглютинации (РГА) используют аллантоисную, амниотическую жидкости, суспензию хорион-аллантоисных оболочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур клеток или органов животных, зараженных вирусами. Реакцию гемагглютинации можно ставить капельным методом на стекле и в развернутом ряду в пробирках или лунках пластин из полистирола. Первый метод является ориентировочным.

Являясь группоспецифической, РГА не позволяет определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса. Смесь выдерживают в термостате, затем добавляют взвесь эритроцитов. Спустя несколько минут определяют титр вируснейтрализующей сыворотки, т. е. максимальное ее разведение, вызвавшее задержку агглютинации эритроцитов.

В серологической диагностике вирусных болезней РТГА рекомендуется ставить с парными сыворотками, одну из которых получают в начале заболевания, а другую – спустя 1 – 2 недели и более. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз.

Реакцию гемадсорбции (РГадс) применяют для индикации в зараженных культурах клеток вируса, обладающего гемагглютинирующей активностью. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, зараженных вирусами, адсорбируются эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию вирусов. Так, например, на клетках, зараженных вирусом натуральной оспы, адсорбируются эритроциты кур; вирусом кори – эритроциты обезьян; аденовирусами – обезьян и крыс и др. (рис. 31).

Рис. 31. Феномен гемадсорбции (по: Лебедева М. Н., 1973)

Репродуцируясь в культурах клеток, вирусы вызывают разного рода ЦПД, выражающееся в округлении, сморщивании, уменьшении или, наоборот, увеличении размеров клеток, слиянии их и образовании симпластов, деструкции цитоплазмы и ядра. Наконец, в монослое клеток, зараженных вирусами, в результате разрушения ими отдельных участков клеточного пласта могут появляться «стерильные пятна», или бляшки, представляющие собой клон вирусной частицы, что дает возможность не только изолировать вирус, но и определить его титр.

Идентифицировать вирус по характеру бляшек очень трудно, и поэтому прибегают к постановке реакции нейтрализации (РН) выделенного вируса заведомо известными вируснейтрализующими сыворотками. С этой целью полученный от больного вирус накапливают в культуре клеток и различные его разведения смешивают с неразведенной противовирусной сывороткой.