Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований

6.5. Применение лабораторных животных в микробиологии

Биологическими называются методы исследований, проводимых на лабораторных животных. Они дополняют и углубляют данные микробиологического исследования. Целью этих исследований является выделение микроорганизмов из исходного материала, в том числе и загрязненного другими микроорганизмами, а также в тех случаях, когда возбудитель не может быть обнаружен методом посева, например при вирусных и риккетсиозных заболеваниях.

На лабораторных животных определяют вирулентность и токсигенность микроорганизмов, воспроизводят характерную клиническую картину (столбняк), изучают вопросы иммунитета, эффективность биологических и антибактериальных препаратов, получают иммунные сыворотки.

Их используют для выделения вирусов, не вызывающих развития цитопатических изменений в культурах клеток и не размножающихся в куриных эмбрионах: некоторых арбовирусов, вирусов бешенства, ящура, лимфоцитарного хориоменингита и др. Применение лабораторных животных позволяет также по клиническому симптомокомплексу идентифицировать характер вирусной инфекции, ставить реакцию нейтрализации, путем пассажей поддерживать лабораторные штаммы вирусов, сохранять антигенные свойства и активность вирусов, изучать в эксперименте течение вирусной инфекции, получать диагностические и лечебно-профилактические вирусные препараты.

Микробиологические исследования чаще всего проводят на белых мышах, морских свинках и кроликах. Для иммунизации в лабораторных исследованиях используют крыс и кроликов, а на производстве – лошадей, баранов и свиней. Некоторые специальные исследования проводят на кошках, мелком и крупном рогатом скоте и крысах. Из птиц используют кур, гусей, уток. В последние годы чаще применяют новорожденных животных (они более чувствительны к вирусам), «стерильных животных» (извлекают из матки и содержат в стерильных условиях с использованием стерильного воздуха и стерилизованного корма) и животных чистых линий с известной наследственностью (инбредных или линейных).

Имеет значение также вид животного, порода, возраст, масса, пол, упитанность, условия содержания. В опыт берут животных одного вида и возраста и содержат их в одинаковых условиях. Иногда используют разные виды животных, обладающих различной чувствительностью к одному и тому же вирусу, что помогает выявить разнообразные формы инфекции.

Для эксперимента берут только здоровых животных, лучше из одного питомника и одной партии. Температуру тела измеряют в одно и то же время, так как имеются ее суточные колебания. Исследуемый материал вводят с учетом тропизма вирусов к определенным тканям. Так, для выделения нейротропных вирусов материал вводят в мозг, для выделения пневмотропных – через нос (под легким эфирным наркозом).

У лабораторных животных после заражения инфекционным материалом важно своевременно и правильно взять материал для дальнейшего исследования, причем асептически. Результаты выделения вируса считают положительными, если у животного после соответствующего инкубационного периода развиваются симптомы инфекции.

Рис. 28. Внутрибрюшинное заражение белой мыши (по: Лабинская А. С., 1973)

При выборе лабораторного животного необходимо учитывать степень его восприимчивости к изучаемому возбудителю. Так, например, морские свинки восприимчивы к туберкулезу, дифтерии, чуме, сибирской язве; мыши – к туляремии, чуме, ботулизму, столбняку, газовой гангрене и т. д. Каждое лабораторное животное, взятое в опыт, маркируют.

Животных перед опытом необходимо зафиксировать и обязательно обезболить. Для обезболивания чаще всего применяют эфирный наркоз. Для этого морских свинок и мышей помещают на короткое время в закрытую стеклянную банку, на дно которой кладут кусочек ваты, смоченный эфиром. Животным более крупных видов накладывают на мордочку маску с эфиром.

При введении материала в вену кролика или взятии крови животное помещают в специальный деревянный ящик, в передней стенке которого имеется регулируемое отверстие для головы. Можно также запеленать кролика в полотенце, предварительно подогнув лапы к животу.

Способы введения исследуемого материала животным могут быть следующими: подкожный, внутрикожный, накожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный (через рот), интраназальный (через нос), интрацеребральный (в мозг) и др. Чаще всего в практической микробиологии используется внутрибрюшинный способ заражения (рис. 28).

6.6. Биохимическая идентификация бактерий

Действие протеолитических ферментов, т. е. способность микроорганизмов расщеплять белки, изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При посеве уколом в столбик желатиновой среды микробы, разлагающие желатин, разжижают среду. Действие микроорганизмов, разлагающих казеин (молочный белок), проявляется в пептонизации (просветлении) молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.

В процессе ферментации пептонов микроорганизмами образуются индол (C

Н

N), сероводород (Н

S), аммиак (NH

) и другие соединения.

Способность микроорганизмов разлагать сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты, а иногда и газа изучают на средах Гисса. В состав этих сред входят пептонная вода, углевод (моносахариды – глюкоза, ксилоза, арабиноза; полисахариды – крахмал, гликоген), многоатомные спирты (глицерин, маннит, сорбит, инозит) и индикатор. Под действием образующейся при разложении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды («пестрый ряд»). Газообразование определяется по наличию пузырьков газа в толщине полужидких сред или, если среда жидкая, в поплавке (стеклянной трубочке, верхний конец которой запаян).

Сахаролитические свойства изучают и на таких средах, как Эндо, Левина, Плоскирева. В их состав входит молочный сахар – лактоза; при разложении его микроорганизмами до кислоты цвет колонии изменяется соответственно индикатору, находящемуся в среде.

Биохимическая активность микроорганизмов обусловлена их ферментативной деятельностью. Ферменты микроорганизмов являются биологическими катализаторами, определяющими метаболические процессы, протекающие в микробных клетках. Разные виды микроорганизмов нередко отличаются по набору ферментов, которые они способны синтезировать.

Плазмокоагулаза выявляется в пробирочном опыте по определению скорости свертывания испытуемым микробом цитратной кроличьей или человеческой плазмы.

Гемотоксин вызывает лизис эритроцитов. Определяется при посеве испытуемых микробов на кровяной агар. Вокруг колонии наблюдается зона просветления среды.

Лецитиназа разрушает лецитовителлин яичного желтка. Обнаруживается при посеве испытуемых микробов на желточно-солевой агар (ЖСА) по образованию вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком.

Гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав соединительной ткани. В пробирку с испытуемой культурой внести гиалуроновую кислоту и после 30-минутной экспозиции при температуре 37 °C добавить две капли крепкой уксусной кислоты. При наличии фермента гиалуроновая кислота утрачивает способность образовывать сгусток.

Фибринолизин растворяет фибрин плазмы крови, добавленной к питательной среде.

Учитывая высокую фенотипическую изменчивость бактерий, необходимо использовать для идентификации стандартизованные методики тестов. Желательно использование минимального числа наиболее важных и легко выполнимых тестов. Вначале используют тесты, определяющие принадлежность бактерий к определенному отделу и группе по «Определителю бактерий Берджи», например, морфология, окраска по Граму, подвижность, наличие спор, отношение к кислороду и т. д. Затем применяют наиболее важные тесты, характеризующие предполагаемый таксон (род, вид).

Для идентификации бактерий наиболее важно определение их биохимических признаков, которые устанавливаются преимущественно с помощью микрообъемной технологии с использованием соответствующих таксону коммерческих тест-систем или приборов автоматических систем идентификации. Для идентификации также широко используют серологические реакции, направленные на выявление антигенов бактерий и их таксонов.

Совокупность полученной информации о свойствах бактерий сопоставляют с характеристикой определенных таксонов в «Определителе бактерий Берджи» или других руководствах и дают заключение о таксономическом положении бактерий.

В последние годы все шире применяются методы геноиндикации микроорганизмов, которые не требуют выделения чистых культур: метод ДНК-зондов, полимеразная цепная реакция (ПЦР) со специфическими праймерами.

6.7. Культивирование и выделение вирусов

В отличие от бактерий вирусы размножаются лишь в живых клетках. В связи с этим культивирование вирусов может осуществляться на уровне организма подопытного животного (куриный эмбрион как развивающийся организм относят к подопытным животным) или живой клетки, выращиваемой вне организма, т. е. на уровне культуры клеток.

В тканях куриного эмбриона, его оболочках, желточном мешке способны размножаться многие патогенные вирусы человека и животных. При этом имеет место избирательность вирусов к той или иной ткани: вирусы группы оспы хорошо репродуцируются и накапливаются в клетках хорион-аллантоисной оболочки, вирус паротита – в амнионе, вирусы гриппа – в амнионе и аллантоисе, вирус бешенства – в желточном мешке.

Культивирование вирусов в развивающихся эмбрионах имеет ряд преимуществ перед другими методами: плотная скорлупа довольно надежно защищает внутреннее содержимое от микроорганизмов; эмбрионы восприимчивы ко многим группам вирусов; при заражении куриных эмбрионов получают больший, чем при других методах культивирования, выход вируссодержащего материала; метод заражения куриных эмбрионов прост и доступен любым вирусологическим лабораториям; эмбрионы обладают достаточной жизнеспособностью и устойчивостью к возбудителям внешних факторов.

Однако куриные эмбрионы не всегда свободны от латентных вирусных и бактериальных инфекций. Трудно наблюдать за динамикой патологических изменений, происходящих в эмбрионе после заражения его вирусом. При вскрытии зараженных эмбрионов часто не обнаруживают видимых изменений и выявляют вирус с помощью реакции гемагглютинации и другими методами. В зараженных эмбрионах невозможно проследить за нарастанием титра антител, поэтому данный метод пригоден не для всех вирусов.

Для вирусологических исследований используют эмбрионы 7 – 12-дневного возраста, которые получают из птицеводческих хозяйств. Можно выращивать эмбрионы в обычном термостате, на дно которого ставят лотки с водой для увлажнения воздуха. Температура в термостате должна быть 37 °C, а влажность воздуха – 60 – 65 %. Отбирают крупные, чистые (но немытые), оплодотворенные яйца от белых кур, хранившиеся не более 10 сут. при температуре 5 – 10 °C. Оплодотворенные яйца распознают по наличию зародышевого диска, который при просвечивании с помощью овоскопа имеет вид темного пятнышка.

При работе с вирусами могут быть использованы различные методы заражения эмбрионов, но наибольшее практическое применение получили нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, введение в аллантоисную, амниотическую полость и желточный мешок. Выбор метода зависит от биологических свойств изучаемого вируса.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона на овоскопе. Живые эмбрионы подвижны, хорошо видна пульсация сосудов оболочек.

При овоскопировании отмечают простым карандашом на скорлупе границы воздушного мешка или место расположения эмбриона, которое определяют по его тени на скорлупе.

Рис. 29. Строение куриного эмбриона (по: Лебедева М. Н., 1973)

Куриные эмбрионы заражают в боксе в строго асептических условиях, используя инструменты, стерилизованные кипячением. При заражении на хорион-аллантоисную оболочку наиболее пригодны 12-дневные эмбрионы (рис. 29). Для заражения в аллантоисную полость используют эмбрионы 10 – 11-дневного возраста, в амниотическую полость – эмбрионы 7 – 11-дневного возраста, в желточный мешок – эмбрионы 7-дневного возраста.

Яйца с зараженными эмбрионами устанавливают на подставках тупым концом вверх. Температурный режим и срок инкубации зависят от биологических свойств инокулированного вируса. Ежедневно жизнеспособность эмбрионов контролируют под овоскопом. Эмбрионы, погибшие в первые сутки после заражения вследствие травмы, не исследуют.

Перед сбором материала эмбрионы охлаждают при температуре 4 °C в течение 18 – 20 ч для сужения сосудов и предотвращения кровотечения при вскрытии. Вскрывают их в боксе с соблюдением правил асептики.

Аллантоисную жидкость насасывают пипеткой, контролируют стерильность путем посева в сахарный или мясо-пептонный бульон, проверяют на наличие вируса в реакции гемагглютинации и хранят при температуре –4 °C (в замороженном состоянии).

Для получения амниотической жидкости вначале отсасывают аллантоисную жидкость, затем пинцетом захватывают амниотическую оболочку, слегка приподнимают ее и пастеровской пипеткой отсасывают амниотическую жидкость.

При изучении изменений на хорион-аллантоисной оболочке ее разрезают ножницами и через отверстие выливают все содержимое в чашку Петри. Хорион-аллантоисная оболочка остается внутри скорлупы и ее извлекают пинцетом и помещают в чашку Петри с физиологическим раствором. Здесь ее промывают, расправляют и изучают на темном фоне характер очаговых поражений.

Для получения амниотической оболочки амниотический мешок, в который заключен эмбрион, разрезают и освобождают от эмбриона, просматривают на наличие поражений.

Для получения желточной оболочки разрезают хорион-аллантоис, отсасывают аллантоисную и амниотическую жидкости, извлекают пинцетом плод, отделяют его за пупочный канатик, захватывают желточный мешок и помещают в чашку Петри, затем контролируют на стерильность, просматривают на наличие поражений. Желток в случае необходимости его извлечения можно отсосать шприцем без выведения наружу желточного мешка.