Гемопоэтическая стволовая клетка в патогенезе болезней цивилизации, ее диагностические возможности и биотерапевтический потенциал

Закономерности миграции гемопоэтических стволовых клеток к опухолевым клеткам различных линий in vitro

Для обоснования феномена направленной миграции ГСК в неопластический очаг и выявления некоторых механизмов реализации этого феномена был выполнен эксперимент in vitro, который проходил в 2 этапа:

1. исследование миграции стволовых клеток в сочетанных культурах с клетками различных линий;

2. исследование миграции стволовых клеток человека в сокультурах с клетками злокачественных опухолей различных типов.

Использованы дермальные фибробласты человека (ATCC® PCS-201-012™), астроциты крысы (CTX TNA2 (ATCC® CRL-2006)), клетки злокачественной крысиной глиомы линии С6 (ATCC® CCL-107), линии U-87 MG (ATCC® HTB-14) и T-98G (ATCC® CRL-1690) глиобластомы человека, клетки линии МСА-7 аденокарциномы молочной железы (ATCC® HTB-22) и линии A549 (ATCC® CCL-185) карциномы легких человека, первичная культура CD34

ГСК человека (ATCC® PCS-800-012™). Перед началом эксперимента все клетки протестированы на контаминацию микоплазмой с помощью Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC® 30—1012K™).

Для изучения закономерностей миграции СК и выявления некоторых механизмов и особенностей реализации этого феномена выполнен эксперимент in vitro, который проходил в 2 этапа. Задачей первого этапа было выявление особенностей взаимодействия ГСК с опухолевыми и нормальными высокодифференцированными клетками – фибробластами и астроцитами.

Миграция стволовых клеток млекопитающих в сочетанных культурах с клетками различных линийin vitro

Для создания сочетанных культур использовали культуральные вставки с размером пор 12 мкм (Millipore, США). Дно лунок культурального планшета (Grinner BioOne, США) покрывали полиэтиленимином, а затем ламинином (Gibco, США). В каждую лунку планшета помещали пористую культуральную вставку с диаметром пор 12 мкм, которую фиксировали каплей стерильного парафина (рис. 1). Планшет заполняли средой DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, США)) с пониженным содержанием глюкозы и добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 100 U/мл пенициллина (стрептомицина). Все реагенты производства компании Gibco (Thermo Fisher Scientific, Inc., США).

Рис. 1.?Схема эксперимента по изучению миграции СК in vitro. А. Общая схема эксперимента. Вставка содержит: 1 – клетки глиомы С6; 2 – астроциты; 3 – фибробласты. Зеленым выделены лунки, которые оставляли пустыми, для оценки пассивной миграции клеток. Б. Схематическое изображение наблюдаемого явления: клетки глиомы линии С6 индуцируют миграцию ГСК, которые формируют вал вокруг и проникают внутрь культуральной вставки

Внутрь вставки вносили 0,5 ? 10

 клеток глиомы С6, астроцитов или фибробластов, предварительно окрашенных витальным трейсером Vybrant™ CFDA SE CellTracer (кат. № V12883 Invitrogen™). Планшет с культуральными вставками инкубировали в течение 24 ч, затем на дно лунки планшета снаружи культуральной вставки высаживали по 0,5 ? 10

 ГСК, предварительно окрашенных флуоресцентным маркером CellTracker™ Red CMTPX Dye (кат. № C34552, Invitrogen™).

Клетки культивировали 120 ч (37° C, 5% CO

). Подсчет клеток, мигрировавших сквозь культуральную вставку, проводили с использованием высокоэффективной количественной микроскопии (Cell-IQ, CM Technologies, Великобритания) с временными отрезками 24—48—72—96—120 ч; регистрировали количество Red CMTPX Dye-позитивных объектов как на границе, так и внутри культуральной вставки. Полученные результаты верифицировали методом цитофлуориметрии.

Спустя 24 ч после начала совместного культивирования наблюдали формирование клеточного вала из флуоресцирующих клеток, располагающихся по периметру культуральной вставки с клетками глиомы. Этот феномен был отчетливо выражен в сокультурах, содержащих опухолевые клетки, и отсутствовал в лунках планшета, где стволовые клетки были совмещены с фибробластами и астроцитами (рис. 2 А—Г).

Рис. 2.?Перераспределение ГСК в планшете при совместном

культивировании через 24 ч. А – опухолевые клетки внутри культуральной вставки; Б – сокультура ГСК и фибробластов: формирование вала не наблюдается, увеличение 5x; В – сокультура ГСК и астроцитов: формирование вала не наблюдается, ув. 10x; Г – сочетанная культура ГСК и клеток глиомы С6 – формирование клеточного вала по периметру культуральной вставки, содержащей опухолевые клетки, ув. 5x

В культурах, содержащих опухолевые клетки, ГСК мигрировали сквозь культуральную вставку и визуализировались среди неокрашенных клеток глиомы в форме округлых объектов, отвечающих на воздействие лазера устойчивым флуоресцентным сигналом, регистрируемым в спектре, соответствующем Red CMTPX (577?602 нм). В культурах, содержащих фибробласты и астроциты, регистрировались только единичные Red CMTPX-позитивные объекты. В культуральных вставках, оставленных пустыми, выявлялись только солитарные клетки, соответствующие спектру флуоресценции ГСК (табл. 2).

Примечание: данные представлены в виде М ± s.e.m., N = 12 для каждой группы, по каждой точке.

Подсчет числа ГСК, мигрировавших сквозь пористую мембрану или сосредоточенных по периметру культуральной вставки, показал четкое увеличение числа флуоресцирующих элементов в сокультурах, содержащих клетки глиомы, начиная со 2-го по 5-й день эксперимента (рис. 3). Значимых динамических изменений числа ГСК на этапах совместного культивирования культур с астроцитами и фибробластами не наблюдали (рис. 4).

Рис. 3.?ГСК человека, мигрировавшие в лунки с глиомой С6.

Окраска CellTracker™ Red CMTPX. Конфокальная микроскопия, флуоресценция при воздействии лазера ? = 546 нм; ув.: об. 10х

Рис. 4.?Динамика накопления стволовых клеток в культуральных вставках, содержащих клетки глиомы линии С6, астроциты, фибробласты, и в контрольных вставках. По оси абсцисс – время сокультивирования

(24—48—72—96—120 ч), по оси ординат – число флуоресцирующих клеток во вставке (М ± s.e.m., N = 9 по каждой точке)

Очевидно, направленная миграция ГСК к клеткам глиомы обусловлена продукцией опухолевыми клетками сигнальных молекул. Поскольку в данном эксперименте были использованы клетки крысиной глиомы линии С6, способность ГСК мигрировать в отношении опухолевых клеток человека нуждалась в уточнении.

Очевидно, направленная миграция ГСК к клеткам глиомы обусловлена продукцией опухолевыми клетками сигнальных молекул. Поскольку в данном эксперименте были использованы клетки крысиной глиомы линии С6, способность ГСК мигрировать в отношении опухолевых клеток человека нуждалась в уточнении.

Миграция стволовых клеток человека в сочетанных культурах с клетками злокачественных опухолей различных линий

В данном эксперименте использованы клетки аденокарциномы молочной железы и карциномы легких человека; кроме того, 2 типа клеток глиобластомы: а) клетки общего пула опухоли; б) опухолевые стволовые клетки (ОСК) глиобластомы.

Для получения ОСК клетки глиобластомы культивировались в среде DMEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) без добавления сыворотки, с добавлением L-глутамина (2 мМ), B-27 (0,5 мМ), основного фактора роста фибробластов (20 нг/мл), эпидермального фактора роста (20 нг/мл), пенициллина / стрептомицина (100 ед./мл) и гепарина (5 мкг/мл). ОСК выделяли из глиомасфер на основании экспрессии антигена CD133, используя MicroBead (кат. №130-100-857; Miltenyi Biotec, Inc.). Чистота популяции ОСК, по данным проточной цитометрии (антитела CD133/1-VioBright FITC (кат. №130-105-226; Miltenyi Biotec, Inc.)), составила 96,72%.

Все опухолевые клетки и фибробласты (контроль), используемые в эксперименте, окрашивали Vybrant™ CFDA SE CellTracer, вносили внутрь культуральной вставки в количестве 0,5 ? 10

. Пространство снаружи культуральной вставки планшета заполняли нейральными прогениторными клетками (НПК) человека (Neural Progenitor Cell Origin ATCC-BXS0117 Normal; Human (ATCC® ACS-5003™)), или ГСК человека в количестве 0,5 ? 10

. Клетки были окрашены флуоресцентным маркером CellTracker Red CMTPX Dye. Культивирование проводили в течение 120 ч при стандартных условиях. Результаты сравнительного анализа миграционной активности клеток в смешанных культурах представлены на рис. 5.

Нейральные прогениторные клетки (НПК) обладали существенно большей подвижностью при сокультивировании с CD133

ОСК линий U-87 и T98G (+926 и +913,1% от контроля). Аттрактивность НПК в отношении общего пула клеток линий U-87 и U-251 была менее выраженной (+598,7 и +688,8% от контроля) и сопоставима с опухолевыми клетками иного происхождения. ГСК, несколько уступая НПК в способности мигрировать к CD133

-клеткам глиобластомы, тем не менее активно мигрировали к этим клеткам (+618,2% к ОСК U-87 и +623,8% к ОСК T98G по сравнению с контролем). Общий пул клеток глиобластомы обладал меньшей аттрактивностью для ГСК (U-87 +449,2% и T98G +523,7% в сравнении с контролем), что сопоставимо с миграцией ГСК к клеткам рака молочной железы (439,2%) и рака легкого (516,8%).

Рис. 5.?Количество НПК, ГСК и фибробластов, мигрировавших через культуральную вставку, через 120 ч совместного культивирования. По оси ординат – количество клеток ? 10

, данные представлены в виде М ± s.e.m., N = 15 для каждой группы

Обращала внимание выраженная сильная способность глиобластомы привлекать высокодифференцированные клетки – фибробласты. При этом наилучшей подвижностью эти клетки обладали в отношении ОСК (U-87 +897,6% и T98G +889%); клетки общего пула глиобластомы обладали несколько меньшей способностью индуцировать миграцию фибробластов, которая была сопоставима с неопластическими клетками рака молочной железы (380,9%) и легкого (574,9%).

Итак, нейральные прогениторные клетки обладали существенно большей подвижностью к клеткам глиобластомы в сравнении с клетками других типов. Миграционная активность НПК зависела от типа опухолевых клеток в сокультуре, и они более активно мигрировали к ОСК двух типов глиобластомы. Дифференцированные клетки глиобластомы обладали несколько меньшей способностью индуцировать миграцию НПК, однако опухолевые клетки ненейронального происхождения существенно слабее индуцировали процессы миграции нейральных стволовых клеток.

Следует отметить, что по мере приближения ГСК к культуральной вставке и их проникновения внутрь в популяции клеток глиобластомы индуцировалась высокая подвижность. В серии снимков, выполненных в режиме реального времени, с интервалом 3 ч (через 23, 26, 29 и 48 ч после начала эксперимента), видно, что клетки глиобластомы активно передвигались по дну планшета внутри культуральной вставки и как бы собирали мигрирующие к ним ГСК. Через 48 ч наблюдения практически все неопластические клетки были «облеплены» мигрирующими клетками (рис. 6).

Рис. 6.?Динамический ряд клеток U-87 глиобластомы в сокультуре с CD34

 ГСК. Опухолевые клетки окрашены CellTracker™ Red CMTPX (красный), а ГСК – Vybrant® CFDA SE (зеленый). Стрелкой показана активно перемещающаяся клетка глиобластомы, к поверхности которой адгезируют ГСК. А – 23 ч, Б – 26 ч, В – 29 ч, Г – 48 ч. Флуоресцентная лазерная микроскопия в режиме реального времени. Масштаб 400 мкм

Взаимодействие стволовых клеток человека с клетками злокачественных опухолей in vitro

Способность нормальных стволовых клеток мигрировать и взаимодействовать с опухолевыми клетками требует изучения закономерностей такого взаимодействия. Для ответа на эти вопросы была выполнена серия экспериментов in vitro, в которых использованы клетки глиомы линии С6, глиобластомы линии U-87, клетки аденокарциномы легкого линии А549 и рака молочной железы МСF-7. Для каждой модели выполнены визуальное и цитометрическое изучение процесса взаимодействия ГСК с опухолевыми клетками и автоматизированный мониторинг процесса сокультивирования стволовых и опухолевых клеток в соотношении 3:1; 1:1 и 1:3 в режиме реального времени.

Взаимодействие гемопоэтических стволовых клеток на модели глиомы линии С6

В рамках подготовки экспериментов 0,5 ? 10

 клеток глиомы линии С6 после окраски витальным трейсером CFDA SE были внесены в лунки планшета, где инкубировались при стандартных условиях. Спустя 6 ч неприкрепившиеся опухолевые клетки были отобраны и в культуру внесено 0,5 ? 10

 ГСК, окрашенных флуоресцентным трейсером Red CMTPX. В качестве контроля использовали фибробласты, которые после окраски маркером Red CMTPX вносили в культуру опухолевых клеток в соотношении 1:1.

Через 6 ч клетки линии С6 визуализировались в виде веретеновидных или полигональных образований, отвечающих стойким флуоресцентным сигналом на воздействие лазера (? = 488 нм). В свою очередь, ГСК при воздействии лазера другого типа (? = 546 нм) формировали флуоресцентный сигнал, визуализируясь в форме округлых образований (рис. 7 А, Б).