Гемопоэтическая стволовая клетка в патогенезе болезней цивилизации, ее диагностические возможности и биотерапевтический потенциал

, lin

, экспрессировали CD13. Кроме того, обнаружено, что магнитная селекция с применением антител к молекуле CD13 способствовала удалению значительной пропорции CD34

-, CD38

-клеток. Таким образом, подтверждается наличие рецепторов к данной молекуле на стволовых гемопоэтических клетках, но следует заметить, что экспрессия CD13 обнаружена на В- и Т-лимфоцитах. При характеристике особенностей субпопуляционного состава CD34

-клеток установлено, что CD13 появляется на достаточно ранних этапах, практически в самом начале дифференцировки клеток-предшественников, и уровни его сохраняются достаточно долго. Хотя, возможно, молекула CD33 и появляется на начальных этапах дифференцировки (пре-КОЕ-ГМ), но, вероятно, постепенно утрачивается по мере гранулоцитарной дифференцировки.

Кроме перечисленных антигенов ранних этапов дифференцировки, на клетках-предшественниках отмечена экспрессия целого ряда более поздних кластеров дифференцировки.

Описана также коэкспрессия на КПГ линейно рестриктированных маркеров лимфоидного звена, как Т-клеток, так и В-клеток. В частности, описана небольшая фракция CD34

-клеток костного мозга, коэкспрессирующих CD7, причем данные клетки имели миелоидный дифференцировочный потенциал и в культуре in vitro формировали гранулоцитарно-макрофагальные колонии клеток (Cannabon et al., 1992). Популяция CD34

-, CD7

-клеток, способных образовывать как Т-клеточные, так и миелоэритроидные колонии, выделена также из тимуса человека (Kurtzberg, Waldman, 1989). Кроме того, обнаружено, что CD34

-, CD7

-популяция клеток из эмбриональной печени человека, дифференцирующихся в тимической культуре в Т-клетки, содержит также примитивные клетки-предшественники с характеристикой КОЕ-ВПП (Barcena, Muench, 1993). В ряде работ показано, что полипотентные клетки мышей экспрессируют CD4-антиген; выявлена популяция CD34

-клеток костного мозга человека, также коэкспрессирующая данный антиген. Функциональные исследования in vitro выявили, что во фракции CD34

-, CD4

-клеток присутствовал целый ряд клоногенных предшественников: КОЕ-ГМ, КОЕ-Э, КОЕ-Мег, а также клетки, инициирующие долгосрочные клеточные культуры (Louache, Debili, 1994; Wineman, Gilmore, 1992).

В отношении В-клеточной лимфоидной рестрикции (Janossy et al., 1991) к сказанному выше следует добавить, что пропорции CD34

-клеток периферической крови и костного мозга, экспрессирующие В-клеточный антиген CD19 и общий (common) антиген CD10, в процентном отношении несколько различаются – содержание таких клеток в периферической крови ниже, чем среди КПГ костного мозга (Bender et al., 1991). Дополнительно нами установлен факт существования CD34

CD10

-клеток, не экспрессирующих пан-В-клеточный антиген CD19 (Grivtsova, Tupitsin, 2016). Данный факт подтверждает возможность мобилизации наиболее ранних субпопуляций стволовых кроветворных клеток.

Изучение субпопуляционного состава ГСК не только является фундаментальным аспектом, дающим более детальное представление о биологии стволовой клетки, но также очень важно с практической точки зрения. Не секрет, что у части больных мобилизация бывает неуспешной, а у части, даже в случае набора достаточной для восстановления кроветворения дозы стволовых кроветворных клеток, оптимального восстановления одного или нескольких ростков не происходит. Одним из возможных объяснений являются особенности субпопуляционного состава CD34

-клеток. При этом особенности субпопуляционного состава CD34

-клеток крови могут определять эффективность мобилизации; особенно значимой в данном контексте оказалась субпопуляция CD34

CD

стволовых клеток крови (Андреева, Тупицын, 2015).

Нозологическая форма заболевания у онкологических пациентов также отразилась на субпопуляционном составе мобилизованных СКК (Гривцова, 2016). Кроме того, оказалось, что субпопуляционный состав СК отличается у онкологических больных взрослого возраста и детей, больных раком; также имеются различия в количестве отдельных субпопуляций у онкологических больных и здоровых доноров (Grivtsova, Tupitsin, 2016).

Исследования субпопуляционного состава мобилизованных ГСК значимы не только для онкологических больных; изучаются особенности пула стволовых клеток и при других фатальных заболеваниях, таких как боковой амиотрофический склероз (Tupitsyn et al., 2006). Показано, что мобилизованные СК (CD34

) больных позднего периода травматической болезни спинного мозга гетерогенны по экспрессии CD45, CD38, мономорфных детерминант HLA-DR, эпитопов трансдуцерной молекулы ИЛ-6 -gp130 (CD130). У большинства пациентов обнаруживается фракция CD34

-клеток, на которых отсутсвует или представлен с низкой плотностью общелейкоцитарный антиген CD45. Пропорция наиболее примитивных ГСК (HLA-DR-CD38

) клеток лишь у 2 пациентов была> 15% в пределах CD34

-клеток. Интересным оказалось то, что экспрессия gp130- общей трансдуцерной молекулы цитокинов семейства ИЛ-6 на CD34

-клетках имела место во всех случаях, у 26% больных – в активированной форме (сочетание эпитопов С7 + А7).

Таким образом, особое значение, на наш взгляд, приобретает исследование субпопуляционного состава CD34

-клеток. Полученные данные указывают на неоднородность состава циркулирующих в крови и трансплантируемых клеток-предшественников гемопоэза. Наличие антигенов CD13 и CD33 указывает на миелоидную направленность дифференцировки, а экспрессия CD7 и CD2, часто в сочетании с В-линейными антигенами CD19, CD20, CD10, свидетельствует о лимфоидной коммитированности клеток-предшественников. Возможно, пропорция HLA-DR-негативных клеток в CD34-позитивном пуле отражает фракцию истинно стволовых клеток. Однако для подтверждения этого факта потребуются дополнительные опыты, целью которых явится экспериментальная проверка отсутствия миелоидно-коммитированных клеток с фенотипом HLA-DR-. Важным подтверждением существования субпопуляций в пределах пула CD34

-клеток является наличие сильных ассоциативных связей между отдельными антигенами. Эти связи наиболее выражены между линейно не рестриктированными антигенами и некоторыми миелоидными маркерами, а также ранними Т- и В-линейными маркерами. Последнее, на наш взгляд, указывает на то, что коммитированность по лимфоидной линии, по-видимому, касается как Т-, так и В-лимфоцитопоэза и происходит синхронно, а не разобщенно. Накопление этих данных может помочь в решении вопросов полноты и стабильности гемопоэза на основе субпопуляционного состава стволовых клеток. К сожалению, приходится признать, что практическое решение этих вопросов пока нигде в мире не достигнуто. Препятствиями служат как сама процедура трансплантации, при которой больному вводится материал, собранный за несколько (обычно 2—3) лейкаферезов, так и недостаточная иммунологическая оценка субпопуляционного состава трансплантируемого материала и показателей иммунитета в посттрансплантационном периоде.

Детальные сведения о мембранном иммунофенотипе стволовой клетки, а соответственно, и о субпопуляционном составе пула стволовых кроветворных клеток чрезвычайно важны как с клинических (прогноз скорости восстановления каждого конкретного кроветворного ростка), так и с фундаментальных (понимание особенностей дифференцировки нормальных клеток крови на ранних этапах кроветворения) позиций.

С учетом полученных различий в субпопуляционном составе ГСК у онкологических больных разного возраста и здоровых доноров можно взглянуть на проблему более широко и обсуждать возможность присутствия у онкологических больных некоего травмированного пула ГСК.

Несмотря на то что трансплантация ГСК и трансплантация костного мозга осуществляется в России более 70 лет, специальных отечественных препаратов, содержащих ГСК, не существует, а трансплантации ГСК и подбор доноров костного мозга осуществляются только как «трансплантация костного мозга», на основе гистосовместимости и количества ГСК. Не существует и официальных клеточных препаратов для восстановления поврежденного гемопоэза после химиотерапии (ХТ) и лучевой терапии (ЛТ). При угнетении миелоидного ростка при ХТ или ЛТ (преимущественно при облучении плоских костей – грудины и таза) быстро (7—12 дней) или отсроченно (3—6 нед.) возникает нейтропения, опасная развитием инфекционных осложнений, грибковых поражений, повреждений кожи (мукозид, раны, трещины); присоединяются сопутствующий иммунодефицит и ЦМВ-инфекция. К лечению добавляют антибиотики для лечения внутритканевой инфекции и Г-КСФ (нейпоген, граноцид, нейпомакс, грановесил и т.д.). Тромбоцитопения опасна развитием геморрагического диатеза, поэтому применяется тромбоцитопенический концентрат. Поэтому вопрос о новых клеточных продуктах, которые могут быть использованы для терапии осложнений и побочных эффектов ХТ и ЛТ опухолей, по-прежнему крайне актуален для современной отечественной и мировой онкологии. И перспективными здесь могут оказаться и стволовые кроветворные клетки в том числе.

Подводя итоги этой главы, следует сформулировать очень важные и концептуальные положения о функциональной и системообразующей роли ГСК в организме человека. Очевидно, что ГСК является не только основной кроветворной клеткой организма человека и прародительницей всех миллиардов клеток гемопоэза и иммунопоэза, но ГСК и ее прямые потомки, клетки-предшественники гемопоэза, являются основным системообразующим компонентом системы биоуправления и саногенеза органов и тканей, базовым элементом регуляции гомеостаза организма человека и причиной формирования большинства болезней цивилизации. Мы считаем, что именно ГСК принадлежит центральное место в возникновении и формировании основных болезней цивилизации человечества.

Глава 3. Состояние проблемы диагностики и лечения фатальных болезней цивилизации

Фатальные, или, другими словами, смертельные, болезни цивилизации – это достаточно большая группа неизлечимых заболеваний населения мира, для которых не существует способов реальной ранней молекулярно-биологической диагностики и пока не создано эффективного лечения. К этой группе заболеваний относят большинство злокачественных онкологических заболеваний (все типы рака, гемобластозы, все типы лимфом, меланома, мультиформная глиобластома и т.д.), нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Бинсвангера, мультисистемная корковая атрофия, мозжечковая атрофия, оливопонтоцеребеллярная дегенерация, боковой амиотрофический склероз и т.д.), аутоиммунные заболевания (рассеянный склероз, рассеянный энцефаломиелит, аутоиммунная миокардиопатия, системная красная волчанка, полимиозит, ревматоидный артрит, сахарный диабет I типа, аутоиммунный тиреоидит и т.д.). Как видите, это далеко не полный перечень самых тяжелых и неизлечимых болезней человечества. Несомненно, эти болезни не занимают первой строчки в ряду смертельных заболеваний человечества и уступают пальму первенства сердечно-сосудистым заболеваниям, но они стоят на втором и третьем местах по смертности населения в мире и на первом месте по степени инвалидизации населения и утрате трудоспособности.

Почему эти заболевания называют фатальными болезнями цивилизации? Как ни удивительно, это связано с тем, что этих болезней не существовало у древних людей, они появились только в последние 100—150 лет. Особенно наглядно это демонстрируют рак и другие злокачественные опухолевые новообразования. Этих заболеваний в принципе не существовало у древних людей, и они появились только в Средние века, когда стала формироваться цивилизация. Древние люди, жившие 2—3 тыс. лет назад, не болели раком. Michael Zimmerman, проф. Университета Манчестера (Manchester University), и его коллега Rosalie David (2015) обследовали сотни мумий в безуспешных попытках найти следы злокачественных опухолей у древних людей. В течение 10 лет они изучили сотни мумий Древнего Египта и Южной Америки возрастом ок. 3 тыс. лет и не нашли у них явных признаков опухолей. Лишь у одной египетской мумии вроде бы обнаружился рак толстой кишки. В литературных источниках, включая древнейшие письменные свидетельства, нет намеков на заболевание, которое спустя тысячелетия стало чуть ли не самой массовой причиной смертности населения. Парадоксальный вывод: рак – современное заболевание, которое спровоцировано загрязнением окружающей среды и неправильным питанием (Zimmerman, David, 2017).

В настоящее время, несмотря значительные успехи в лечении рака, определенные формы рака (рак легких, рак печени и т.д.) и других злокачественных новообразований (некоторые гемобластозы, мультиформная глиобластома, меланома, миеломная болезнь, лимфома и др.) остаются неизлечимыми и фатальными. Нет лечения и возможности предотвращения быстрого летального исхода при диагностике бокового амиотрофического склероза (БАС), который современные неврологи называют еще болезнью моторного нейрона (БМН). Время жизни пациентов с установленными диагнозами некурабельного рака, ряда неизлечимых ЗНО и БАС составляет 1—3 года. До 5 лет и более с этими диагнозами доживают не более 10—15% больных. Диагностика этих фатальных заболеваний крайне затруднена и часто запаздывает, а установленный диагноз – это уже «приговор без права на помилование». Так, диагноз боковой амиотрофический склероз (БАС) устанавливают только клиническим и нейрофизиологическим способами, когда у пациента уже погибло более 70—80% мотонейронов и восстановление невозможно. Молекулярно-биологическая диагностика нейрофиламентов в ликворе больных с БАС также позволяет поставить диагноз только тогда, когда уже разрушены мотонейроны, а это всегда поздно и смертельно для пациента. Аналогичная ситуация и при других нейродегенеративных заболеваниях, когда повреждение нейронов уже необратимо и помочь больному практически невозможно.

Если представить перед собой линейную плоскость, на которой расположились все существующие смертельные заболевания человека, то злокачественные опухоли расположатся на ней на одной стороне, а на противоположной стороне будут находиться нейродегенеративные заболевания и в первую очередь БАС. Это действительно две крайние точки в существующем континууме неизлечимых заболеваний организма человека и две крайние противоположности среди всех смертельных болезней человечества. БАС – это заболевание, которое сопровождается массивной нейродегенерацией передних рогов спинного мозга, гипотрофией и атрофией мышц туловища и конечностей, т.е. формированием синдромов «минус-ткань» в организме, а злокачественные новообразования сопровождаются пролиферацией, отеком ткани, разрастанием и миграцией клеток и формированием в организме синдрома «плюс-ткань». Поэтому мы предположили, что сравнительный анализ этих двух противоположных патологических феноменов абсолютно разных смертельных болезней может дать ключ к решению проблемы их ранней диагностики и диагностики других малокурабельных нейродегенеративных заболеваний нервной системы (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, оливопонтоцеребеллярная дегенерация, системные корковые и мозжечковые атрофии и т.д.), а также поможет понять, какими способами лечения можно их вылечить или хотя бы остановить прогрессирование болезни.

Показано, что ранняя диагностика любого неизлечимого заболевания у человека дает ему определенный шанс на увеличение продолжительности жизни и последующего выживания в результате своевременно начатого лечения. В современной онкологии существует ранняя молекулярно-биологическая диагностика (МБД) рака и других ЗНО, которая основана на выявлении молекул онкоспецифических белков (ОСБ), или т.н. онкомаркеров, в биологических жидкостях пациента (кровь, моча, ликвор и т.д.). Онкомаркеры позволяют выявить у человека рак и ЗНО на I—II стадиях и после адекватного и своевременного лечения обеспечить ему 5-летнюю медиану выживаемости. Было продемонстрировано, что показатели выживаемости от рака увеличиваются в 2—3 раза именно при ранней диагностике ЗНО с использованием онкомаркеров в виде ОСБ. То есть, ранняя диагностика способствует повышению медианы 5-летней выживаемости раковых больных в 2—3 раза, а в ряде случаев и полному выздоровлению больных (Давыдов и др., 2017). Современные критерии ранней диагностики рака и ЗНО позволяют диагностировать канцерогенный процесс тогда, когда он уже получил определенную канцерогенную тканеспецифичность и тканевую «прописку», что зачастую бывает достаточно поздно, когда рак, при минимальном первичном очаге и высокой злокачественности, уже дал множественные отдаленные метастазы. Обнаружение онкомаркеров позволяет заподозрить наличие опухоли в организме на относительно ранней стадии, проводить масштабные скрининговые исследования и отслеживать динамику болезни в процессе лечения. При выявлении в процессе скрининга повышенного уровня одного из онкомаркеров требуется проведение дополнительных методов исследования, без которых постановка диагноза неправомочна.

В настоящее время диагноз БАС (англ. Amyotrophic Lateral Sclerosis, или сокр. АLS) или БМН устанавливают только клинически и по данным электронейромиографии (ЭНМГ), когда больного спасти практически невозможно и у него осталось не более 10—15% мотонейронов в нервной ткани. Ранней МБД БАС и реального лечения при БАС нет. И если для ранней диагностики рака уже были найдены ранние онкомаркеры заболевания, то для БАС их просто не существует, и в этой связи прогноз при диагнозе БАС звучит более трагично, чем прогноз при диагностике рака или других ЗНО. Определенные формы рака имеют шансы на излечение, а вот ALS в современном его понимании – нет. Смерть при раке менее мучительна и сопровождается утратой сознания и комой на фоне раковой интоксикации, а смерть при БАС происходит при полном осознании пациентом происходящего от паралича дыхания при продолжающихся биениях сердца. Онкомаркеры – это онкоспецифические белки, появляющиеся в цитоплазме ОК в результате 4—5 генетических мутаций ее генома. При БАС также описан в цитоплазме мотонейронов целый спектр патологических белков, возникающих в результате мутаций ряда генов, таких как SOD1, FUS, TD43 и др. Но обнаружение их молекул в крови не позволяет диагностировать БАС.

Роль иммунной системы в развитии рака, почти всех ЗНО и БАС принципиальна, хотя во многом неоднозначна и преимущественно негативна. Очевидно, что во всех случаях этих смертельных заболеваний имеет место избирательная (селективная) функциональная недостаточность иммунной системы (НИС), которая имеет важное значение в патогенезе и патоморфологии этих заболеваний. Так, при большинстве запущенных форм рака и ЗНО с распространенными метастазами иммунная система пациента никак не реагирует на генерализацию опухолевого процесса и наличие у больного первичных огромных опухолевых узлов и распространенных метастатических новообразований. Опухолевые клетки легко уклоняются от уничтожения натуральными киллерами врожденного иммунитета и цитотоксическими Т-клетками приобретенного иммунитета, и эти механизмы подробно описаны учеными. При этом при раке и при всех ЗНО избирательно нарушается только противоопухолевая функция иммунитета, а все другие функции иммунитета (противомикробная, противовирусная, противогрибковая, борьба с простейшими и т.д.) практически не страдают. Иммунный статус у этих онкобольных соответствует показателям нормы или около нее. Аналогичная ситуация с иммунной системой наблюдается и при БАС. Несмотря на то что долгое время заболевание считали аутоиммунным, существенных количественных изменений клеточного и гуморального иммунитета при БАС не выявлено. Более того, в последние годы аутоиммунный генез БАС неврологи во всем мире вообще стали считать необоснованным, т.к. нет эффекта от применения стандартной терапии при аутоиммунных заболеваниях: 1) нет достижения ремиссии болезни при терапии глюкокортикоидными гормонами; 2) нет эффекта от аутологичной трансплантации костного мозга (ТКМ), как при рассеянном склерозе и других аутоиммунных болезнях соединительной ткани; и 3) нет результата от применения блокаторов интерлейкинов и других препаратов, направленных на уменьшение системного воспаления и деструкции ткани.

Однотипность иммунологических реакций организма при этих двух полярных заболеваниях позволяет предположить схожесть патогенетических механизмов их развития с определенными вариациями и особенностями их морфологического дефекта в клетках иммунной системы. Оба этих заболевания имеют в своей основе доказанный генетический дефект – статистически достоверные транскриптомные и протеомные нарушения, что позволило нам заподозрить, что в основе их молекулярно-биологического дефекта лежит повреждение ГСК как родоначальницы всех клеток системы кроветворения и иммунитета у человека. ГСК, или стволовые кроветворные клетки, – очень малочисленная, но гетерогенная клеточная популяция, объединяющая в себе несколько типов (субпопуляций) клеток, отличающихся по уровням дифференцировки и способности к пролиферации. Среди них присутствуют как недифференцированные, практически не делящиеся стволовые клетки (СК), так и коммитированные (ограниченные в направлении дифференцировки) клетки-предшественники. Концентрация стволовых клеток (СК) в периферической крови в состоянии стабильного кроветворения мала – менее 0,01%, – что делает затруднительным их изучение даже самыми чувствительными методами (Гривцова, Тупицын, 2017). Но именно ГСК имеют самый большой клеточный цикл среди всех клеток организма человека (360 дней), являются основной регуляторной и управляющей системой в существующей иерархии всех клеточных систем организма, первыми реагируют на мутации генов в клетках и появление асептического воспаления в патологических тканях и органах, мигрируют туда на градиент концентрации воспаления из костного мозга, адгезируют к патологическим клеткам и «направляют их развитие» в сторону дифференцировки или апоптоза по механизму bystander effect. ГСК в зоне воспаления осуществляют горизонтальный и вертикальный информационный обмен цитоплазматическими белками с патологическими клетками (рис. 1, 2). Эти научные факты нами были изучены и опубликованы ранее в научной литературе (Брюховецкий И. С. и др., 2014; Милькина и др., 2016), они описывают универсальный механизм формирования патоспецифического протеома в ГСК. В зависимости от мутационного повреждения клеток-мишеней в тканях ГСК происходят геномно-протеомное повреждение ГСК и формирование из них опухолевых стволовых клеток или клеток, получивших вакцинацию иммуноспецифическими белками, что мы показали в своих исследованиях по онкопротеомике стволовых клеток (Брюховецкий А. С., 2014). Поэтому целью настоящего способа диагностики стало прицельное изучение и выявление патологической специфики протеомных профилей белковых маркеров клеточной поверхности ГСК при таких смертельных заболеваниях, как рак и другие ЗНО, а также БАС, что имеет большое значение для выявления уникальных иммуноспецифических характеристик молекулярного ландшафта клеточной поверхности ГСК как фундаментальных молекулярно-биологических критериев для ранней диагностики этих неизлечимых заболеваний.

Глава 4. Фундаментальные аспекты проблемы: взаимодействие гемопоэтических стволовых и опухолевых клеток in vitro (соавт. д.м. н.

И.С. Брюховецкий)

Одним из ключевых этапов эволюции многоклеточных организмов стало появление способности к специфическому координированному межклеточному взаимодействию, что сделало возможным согласованную регуляцию метаболизма, дифференциацию клеток и проявление физиологических функций дифференцированных клеток (акад. М. А. Пальцев, 2003). Вектор взаимодействия стволовой и дифференцированной клеток определяется локальными микроусловиями среды, однако только в патологии и клинике можно понять всю глубину адаптивных возможностей организма. В этой главе мы остановимся на закономерностях межклеточного взаимодействия ГСК с нормальными и патологически измененными, а именно опухолевыми клетками.