Гемопоэтическая стволовая клетка в патогенезе болезней цивилизации, ее диагностические возможности и биотерапевтический потенциал

На 8—15 сут. эксперимента на препаратах мозга крыс контрольной группы объекты, соответствующие форме и размеру ГСК и флуоресцирующие длине волн, соответствующих зеленому спектру (CFDA SE 492/517), не обнаруживались.

В паренхиматозных органах (легкие, печень, почки, вилочковая железа) животных контрольной и экспериментальной групп в течение 3—5 сут. после введения обнаруживаются единичные флуоресцирующие клетки, достаточно сложно дифференцируемые от интенсивной аутофлуоресценции исследуемых органов (рис. 29).

Рис. 29.?Ткани паренхиматозных органов крыс контрольной группы (без глиомы С6), получивших трансплантацию гаплоидентичных гемопоэтических (СD34

) стволовых клеток. Окраска CFDA SE, мультифотонная флуоресцентная лазерная микроскопия (? = 488 нм). А, Б – легкие; В, Г – печень; Д, Е – почки; Ж, З – вилочковая железа. А, В, Д, Ж – ядра клеток докрашены DAPI. Масштаб 100 мкм.

Следует отметить, что в селезенке животных обеих групп в течение первых 3—5 сут. после введения наблюдается повышение содержания флуоресцирующих клеток в области красной пульпы (Рис. 30Б). В этот же период солитарные флуоресцирующие объекты обнаруживаются в красном костном мозге животных, получавших гемотрансфузию ГСК (рис. 30 В, Г).

Рис. 30.?Транзиторное повышение числа флуоресцирующих клеток в красной пульпе селезенки (Б) и в красном костном мозге (Г) на 3 сут. после введения ГСК, меченных CFDA SE. А – аутофлуоресценция в белой пульпе селезенки интактных животных; В – отсутствие специфического сигнала в красном косном мозге интактных животных. Обозначения: КП – красная пульпа; БП – белая пульпа. В, Г – ядра докрашены DAPI. Масштаб 100 мкм.

При изучении процесса миграции ГСК с использованием красителя Red CMTPX Dye получены идентичные данные. Однако в отличие от клеток, окрашенных CFDA SE, сохраняющих активное свечение в течение 2 нед. после активации в клетках, краситель Red CMTPX Dye сохраняет свою флуоресценцию в течение первых 3—5 дней.

Таким образом, гемопоэтические стволовые клетки, трансплантированные в организм экспериментальных животных с глиомой С6, направленно мигрируют в опухоль, где первоначально (3—5 сут.) накапливаются на границе неопластического очага и на последующих этапах (8—15 сут.) проникают в ткань глиомы и сосредотачиваются в участках некроза опухоли. Закономерностью этого процесса является накопление трансплантированных ГСК непосредственно в опухолевой ткани (47,6 ± 9,3%) и зонах инвазивного роста опухоли (12,7 ± 9,2%). При введении в организм крыс без опухоли ГСК не имеют конечной цели миграции, остаются в пределах капиллярного русла мозга и мозговых желудочков, что является существенной особенностью данного процесса. Трансплантированные клетки практически не обнаруживаются в паренхиматозных органах (легкие, печень, почка, вилочковая железа), а транзиторное повышение их количества в селезенке может свидетельствовать об их разрушении в красной пульпе при введении в системный кровоток.

Взаимодействие гемопоэтических стволовых клеток с клетками глиомы С6 в опухолевом очаге

Целью данного этапа работ являлось изучение закономерностей и механизмов воздействия ГСК на течение опухолевого процесса в мозге in vivo. Поскольку в работах, описанных выше, была использована ксенотрансплантация клеток костного мозга человека в организм крыс с глиомой С6, получивших предварительную иммуносупрессивную терапию, то для изучения закономерностей взаимодействия ГСК с клетками глиобластомы in vivo мы отказались от этой модели.

Одним из ведущих способов получения клеток костного мозга для использования в онкологической практике является рекрутирование гемопоэтических стволовых клеток в системный кровоток путем стимуляции гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ), с последующим сбором лейкоконцентрата мононуклеарных СD45

-клеток, содержащих значительное количество CD34

ГСК. В этой связи план работ включал 2 принципиально значимых этапа: 1) иммобилизация аутологических ГСК в системный кровоток экспериментального животного с глиомой С6; 2) характеристика иммуногистохимических трансформаций опухолевого узла в мозге крыс с рекрутированными в системный кровоток ГСК.

Рекрутирование ГСК в системный кровоток экспериментального животного с глиомой С6

Животным вводили подкожно Г-КСФ (Filgrastim, кат. № YY0101173 Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 4 мг/день, в течение 7 дней. Иммобилизацию мононуклеарных CD45

-клеток проверяли путем анализа крови экспериментальных животных с помощью проточного цитометра Navios™ (Beckman Coulter, США). В исследовании использовали антитела против крысиного CD45 (ОХ-1, конъюгированный с APC / Cy7, кат. №202216, Biolegend Inc., США). Данные цитофлуориметрии обрабатывали с помощью Navios Software v. 1.2 и Kaluza™ v. 1.2 (Beckman Coulter, США).

По данным проточной цитометрии, стимуляция животных Г-КСФ сопровождалась значительным увеличением числа CD45

мононуклеарных клеток в периферической крови экспериментальных животных с глиомой С6 (рис. 31), при этом количество клеток CD45

, экспрессирующих основной маркер ГСК – мембранный антиген, – возрастало до 30,0 ± 1,3%, что указывает на исключительно сильное иммобилизующее действие Г-КСФ. Важно, что мы не нашли коммерческих наборов для идентификации СD34

-клеток крысы, однако «боковая популяция» ГСК-подобных клеток идентифицирована по методу Telford (2010).

Рис. 31.?Результаты цитометрического анализа образцов крови экспериментальных животных с глиомой С6, получивших стимуляцию Г-КСФ. А – доля CD45

-клеток в общем количестве лимфоцитов. При этом красным маркером выделено количество ГСК-подобных клеток в общем числе CD45

 мононуклеарных клеток; Б, В – результаты цитометрического анализа популяции СD45

-клеток, «боковая популяция» ГСК подобных клеток идентифицирована по методу Telford (2010)

Xарактеристика иммуногистохимических трансформаций опухолевого узла в мозге крыс с рекрутированными в системный кровоток ГСК

В данном фрагменте работы методами иммуногистохимиии выявлялись особенности распределения маркеров пролиферации, стволовости, астро- и микроглии, а также некоторых сигнальных молекул в мозге животных с привитой опухолью (контрольная группа) и после иммобизизации ГСК (группа «клетки»).

Контрольная группа

Средняя продолжительность жизни контрольных животных составила 27,2 ± 5,8 дня. Средний объем опухолевого узла в головном мозге составил 202,1 ± 19 мм

. Для животных этой группы были характерны очень быстрое нарастание неврологических симптомов, снижение и полное исчезновение рефлексов на сгибание и переворачивание, появление одностороннего птоза на стороне опухоли с последующим присоединением признаков застоя на глазном дне, дискоординация между правыми и левыми лапами, появление манежных движений. По мере роста опухоли крысы становились вялыми, неохотно пили воду и отказывались от еды с последующим развитием комы и судорожных симптомов. При морфологическом исследовании тканей мозга выявлялась типичная морфологическая картина, детально описанная ранее.

При иммуногистохимическом окрашивании антителами к ядерному белку пролиферирующих клеток (PCNA) выявлялось резкое возрастание темпов пролиферации в ткани опухоли с 10-го по 20-й дни наблюдения, что, очевидно, связанно с интенсификацией процессов деления опухолевых клеток в связи с формированием неопластической кровеносной сети. Вне опухолевого очага максимальное количество PCNA-позитивных клеток было сосредоточено в прилегающих тканях, зонах лучеобразной инвазии клеток глиомы в ткань мозга и кровеносных сосудах разного калибра (рис. 32 А—Г).

С 20-го по 30-й дни исследования количество пролиферирующих клеток в опухолевой ткани уменьшалось. К этому времени в опухолевой ткани появлялись обширные зоны запустения, некроза (рис. 33 А), а PCNA-позитивные клетки начинали уплотняться, обнаруживали отчетливую тенденцию к смещению к границам опухоли, где процессы пролиферации протекали особенно интенсивно (рис. 33 Б) и сочетались с активной миграцией иммунопозитивных клеток в прилегающие ткани мозга. Отдельные пролиферирующие клетки встречались в ткани мозга на значительном удалении от очага.

Рис. 32.?Иммуногистохимическая реакция на антитела к PCNA. Опухолевый очаг, 20 сут. с начала эксперимента. А – центр опухоли, видны скопления многочисленных PCNA-позитивных элементов; Б – прилежащее у опухоли вещество мозга: 1 – зоны инвазии PCNA

-клеток в ткань мозга, в сочетании с инфильтрацией ими окружающей ткани мозга (2); В, Г – скопление клеток PCNA

 в стенке и по периферии кровеносных сосудов, обведено эллипсом

Рис. 33.?Иммуногистохимическая реакция на антитела к PCNA через 30 сут. развития опухоли. А – центральная часть опухолевого очага; Б – граница опухоли с интактной тканью мозга. Заметно значительное увеличение количества PCNA-иммунореактивных клеток (ИР) в зонах инвазии опухоли. Масштаб 200 мкм

Динамика числа PCNA-позитивных клеток на различных сроках развития опухоли в контрольной группе представлена на рис. 34.

Рис. 34.?Динамика числа PCNA-ИР в ткани глиомы С6 у крыс контрольной группы. По оси ординат – количество ИР-клеток в поле зрения микропрепаратов. Данные представлены в виде М ± s.e.m., n = 30 для каждой группы. Знаком * указаны достоверные (p <0,05) отличия количества PCNA-ИР клеток между 20 и 30 сут. эксперимента

Максимальное скопление микроглиальных клеток регистрировалось с 10-го по 20-й дни наблюдения непосредственно в опухолевой ткани и в прилегающих участках инвазии неопластических клеток в вещество мозга. Значительные скопления небольших IBA1-позитивных клеток с телом вытянутой формы и короткими отростками были сосредоточены в паренхиме мозга на некотором расстоянии от опухоли в области гипертрофированных кровеносных сосудов. Очевидно, скопление микроглиальных клеток в неопластическом очаге с 10-го по 20-й день эксперимента вызвано их миграцией из кровеносных сосудов и окружающих тканей мозга. Число IBA1-позитивных клеток в паренхиме мозга на стороне расположения опухоли существенно превосходило их количество в тканях интактного полушария (рис. 35).

Рис. 35.?Распределение микроглии в мозге животных контрольной группы на 15—20 сут. развития опухоли. Иммуногистохимическая реакция на антитела к специфическому белку микроглии (макрофагов; IBA1), 15 сут. с момента начала эксперимента. А – центр; Б – ткань мозга, непосредственно прилегающая к опухоли; видны клетки активированной микроглии с телами амебоидной формы и короткими отростками (указаны стрелками); В, Г – ткань противоположного опухоли головного мозга на 15-е (В) и 20-е (Г) сутки. Видны единичные IBA1-позитивные клетки

С 20-го по 30-й дни количество микроглиальных клеток в области опухолевого узла уменьшалось. В центре опухоли микроглиоциты уплотнялись, смещаясь к периферии, за счет чего зоны разрежения чередовались с участками скопления IBA1-позитивных клеток, как правило окружающих кровеносные микрососуды. В участках перивазального скопления микроглиоциты округлой и амебоидной формы формировали плотные ряды, окружающие зоны некроза. Значительное количество микроглиоцитов было локализовано вдоль границ опухолевого очага (рис. 36 А—В).

Рис. 36.?Распределение IBA1-ИР клеток в мозге животных контрольной группы на 25—30 сут. развития опухоли. А – неоднородное распределение IBA1-ИР микроглиоцитов в очагах некроза и участках активного роста опухоли; Б – концентрация IBA1-ИР вокруг кровеносного сосуда (обведены в круг) и зоны запустения (обведены маркерным карандашом), окруженные псевдопалисадными структурами (3); В – граница неопластического очага в мозге крыс контрольной группы. IBA1-ИР клетки образуют плотную кайму (1) на границе неопластического очага. 30-й день эксперимента. Дополнительная окраска гематоксилин-эозином

При этом значительно возрастало количество клеток микроглии за пределами опухолевого очага и локализующихся в противоположной гемисфере, что, очевидно, связано с миграцией этих клеток в опухолевый очаг.

К 30 сут. микроглиальные клетки практически не обнаруживались в ткани опухолевого узла и были сосредоточены в виде плотной каймы на границе опухоли с тканью мозга (рис. 36 В). Следуя за клетками глиомы, инфильтрирующими ткань мозга, основная масса микроглии локализовалась в дистрофически измененной паренхиме, окружающей опухолевый очаг. Очевидно, подобная картина обусловлена сложными, специфическими взаимоотношениями микроглии с опухолевыми клетками, в т.ч. с ОСК, что связано с секрецией опухолевыми клетками и микроглией цитокинов, поскольку секреторная функция микроглии в данном случае имеет решающее значение. Динамика числа IBA1-позитивных клеток на различных сроках развития опухоли в контрольной группе представлена на рис. 37.

Рис. 37.?Динамика числа IBA1-иммунореактивных (ИР) клеток в ткани глиомы С6 у крыс контрольной группы в ходе эксперимента. По оси ординат – количество ИР клеток в поле зрения. Данные представлены в виде М ± s.e.m., n = 30 для каждой группы. Знаком * указаны достоверные (p <0,05) отличия количества IBA1-ИР клеток рядом с опухолью и в тканях противоположной гемисферы, знаком *+ – различие в количестве IBA1-ИР клеток по всем точкам эксперимента между 20 и 30 сут.

На 20-е сут. эксперимента у крыс контрольной группы GFAP-позитивные звездчатые клетки концентрировались вокруг опухолевого очага, образуя контур, конгруэнтный зоне опухолевой инвазии (рис. 38 А), и практически не обнаруживались в неопластической ткани (рис. 38 Б). Подобная морфологическая картина сохранялась к 30 сут., однако группировка GFAP-позитивных астроцитов становилась более плотной и компактной (рис. 38 В, Г). GFAP-ИР клетки окружали зону инвазии и отсутствовали в опухолевой ткани. При более предметном морфологическом исследовании тканей мозга крыс контрольной группы GFAP-ИР клетки с телом звездчатой формы с активно ветвящимися отростками образовывали скопления вдоль опухолевого очага и, очевидно, контактировали друг с другом (рис. 38 Д, Е), формируя барьер, противодействующий инвазивному процессу. При этом в ткани мозга противоположного полушария были обнаружены только единичные GFAP-позитивные клетки. При анализе рис. 36 и 38 становится очевидным, что, двигаясь навстречу друг другу, микро- и макроглия стремится отграничить зону инвазии с двух сторон, что проявляется не только в виде локальных перестроек непосредственно на границе опухоли, но и в ткани мозга в целом.

Рис. 38.?Иммуноцитохимическая реакция на антитела к GFAP у крыс контрольной группы. А – край опухоли в мозге контрольных крыс, 20 сут.; Б – ткань опухоли в мозге контрольных животных, 20 сут.; В – опухоль в мозге крыс контрольной группы, 30 сут.; Г – край опухолевого очага в мозге крыс группы контрольной группы, 30 сут.; Д – скопление GFAP-ИР клеток рядом с опухолью, 30 сут.; Е – единичные GFAP-ИР клетки в мозге контрольных крыс в ткани мозга противоположного полушария

На 30 сут. после формирования опухоли участки перифокальной инвазии, содержащие максимальное скопление клеток микро- и макроглии (о чем будет сказано ниже) активно окрашивались антителами к нестину, CXCR4 и TGF-?1 (рис. 39). Нестин принято считать одним из ключевых маркеров нейральных стволовых и прогениторных клеток. Как было указано выше, абсолютное большинство клеток глиобластомы, использованных в эксперименте, окрашивались антителами к этому белку, что служит признаком низкой степени дифференцировки и высокой агрессивности опухолевых клеток.

Ряд авторов относит нестин к одному из маркеров ОСК злокачественных глиом. Скопление нестин-позитивных клеток в области инвазивного роста свидетельствует об их прямом участии в этом процессе. Заслуживает внимание скопление в данном участке клеток, позитивных в отношении CXCR4-антигена. Этот цитоплазматический маркер локализован на поверхности стволовых клеток всех типов и играет ведущую роль в механизмах их миграции в опухолевый очаг. Присутствие маркера CXCR4 может означать наличие в области инвазивного роста нейральных стволовых клеток, мигрировавших из герминативных зон мозга.

Рис. 39.?Край опухоли в мозге крыс контрольной группы, 30 сут. эксперимента. А – иммуноцитохимическая реакция на антитела к белку стволовых клеток нестину. Нестин-позитивные клетки локализуются как на краю очага глиомы (1), так в области инвазии (2) неопластических элементов в вещество мозга. Масштаб 200 мкм; Б – иммуноцитохимическая реакция на рецепторный белок CXCR4. Клетки, несущие этот рецептор, а следовательно, мигрировавшие, локализуются как в области инвазии (1 – показаны на вставке), так и на периферии неопластической ткани (2). Масштаб 100 мкм, вставка 200 мкм; В – иммуноцитохимическая реакция на TGF-?1. Скопление белка выявлено вдоль границы зоны инвазии

Вместе с тем данный маркер локализован и на поверхности раковых или опухолевых стволовых клеток глиобластомы, что может свидетельствовать как об их прямом участии в механизмах инвазии при взаимодействии с микроглией, так и о взаимодействии с мигрировавшими сюда стволовыми клетками других типов, несущих на поверхности рецептор CXCR4. Кроме того, CXCR4 является компонентом клеточной мембраны микроглиальных клеток, привлекаемых опухолью. Вероятно, микросреда, создаваемая ОСК, селективно активирует микроглию М2-фенотипа, которая содействует процессам опухолевого роста и инвазии.