Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии

MBP – основной белок миелина

MOBP – основной белок олигодендроцитов, связанный с миелином

MOG – миелиновый гликопротеин олигодендроцитов

MRF-1 – microglia response factor

NCAM – нейрональная молекула клеточной адгезии

NF-H – высокомолекулярные белки нейрофиламентов

NF-L – низкомолекулярные белки нейрофиламентов

NF-M – среднемолекулярные белки нейрофиламентов

NSE – нейронспецифическая енолаза

OSP – олигодендроцит-специфический белок

PAP – пероксидаза-антипероксидазный метод

PBS – фосфатно-солевой буфер

PCNA – ядерный антиген пролиферирующих клеток

PGP – протеиновые генные продукты

PI – пропидий иодид

PKA – сАМР-зависимая протеинкиназа

PLP – протеолипидный белок

PRD – домен, богатый пролином

PSA – полисиаловая кислота

TBS – трис-солевой буфер

TRITC – тетраметилродамин изотиоцианат

ПРЕДИСЛОВИЕ

В последние годы методы иммуногистохимии заняли одно из главных мест среди методов морфологической диагностики. Неудивительно, что научная и методическая литература, посвященная их применению, привлекает пристальное внимание научных работников и специалистов практического здравоохранения. С сожалением приходится констатировать, что в настоящее время подобная литература отсутствует на прилавках отечественных книжных магазинов. Из наиболее важных руководств, изданных на русском языке после 1990 г., в которых определенное место отведено вопросам применения методов иммуногистохимии, следует отметить «Микроскопическую технику» (под ред. Д. С. Саркисова и Ю. Л. Перова. – М.: Медицина, 1996), «Молекулярную клиническую диагностику» (под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги. – М.: Мир, 1999) и фундаментальный обзор иммуноцитохимических методов М. В. Угрюмова (Итоги науки и техники. Серия «Морфология человека и животных». – Т. 15. – М.: ВИНИТИ, 1991). Перечисленные книги давно стали библиографической редкостью. Кроме того, следует признать, что они не включают информацию о некоторых современных методических приемах, получивших широкое распространение в последние годы (например, о способах теплового демаскирования антигенов). Все вышеперечисленное и побудило авторов к написанию данного краткого руководства.

Отличительной особенностью данного руководства является сочетание необходимых сведений о теоретических основах методов иммуногистохимии с примерами их практического использования на основе оригинальных и усовершенствованных авторами протоколов обработки препаратов, помещенных в приложении. Поскольку в круг интересов авторов входит изучение органов нервной системы, книга дополнена теоретическими сведениями и практическими рекомендациями по использованию важнейших нейрональных и глиальных маркеров дифференциации, что, несомненно, будет полезным как для нейроморфологов, так и для нейрофизиологов.

Настоящее руководство отражает современный уровень развития иммуногистохимии как науки и аккумулирует многолетний опыт сотрудников лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, связанный с использованием методов иммуногистохимии.

    Д. Э. Коржевский

ПРЕДИСЛОВИЕ КО ВТОРОМУ ИЗДАНИЮ

Первое издание этой книги вышло не так давно, но уже появилась необходимость выпустить исправленное и дополненное второе издание. Наибольшие изменения претерпели пятая и шестая главы, где описываются методы демаскирования антигенов и изложены практические приемы, используемые при постановке иммуногистохимических реакций. В шестой главе появился и новый раздел «Организация работы иммуногистохимической лаборатории». Внесено существенное добавление в главу 10 – раздел, посвященный важному нейрональному маркеру – белку PGP 9.5. Протокол обработки препаратов для постановки реакции на белок PGP 9.5 добавлен в приложение 5. Обновлен состав авторского коллектива, принимавшего участие в работе над текстами, вошедшими в состав руководства.

Авторы надеются, что внесенные изменения и дополнения увеличили информативность второго издания руководства, которое адресовано работникам практического здравоохранения и научным сотрудникам, использующим методы иммуногистохимического исследования в своей повседневной деятельности.

    Д. Э. Коржевский

Глава 1.

ИММУНОГИСТОХИМИЯ – СОВРЕМЕННЫЙ МЕТОД МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

Термин «иммуногистохимия» образован из трех составляющих, указывающих на три медико-биологические дисциплины, – иммунологию, гистологию и химию, которые послужили основой для этого нового научного направления. Иммуногистохимия (ИГХ), или иммуноцитохимия (ИЦХ), – это область биологической и медицинской науки, теоретическое обоснование, разработка и практическое применение современных методов гистологического исследования и микроскопической диагностики, базирующихся на использовании реакции «антиген – антитело» для селективного выявления белков (и других молекул, обладающих антигенными свойствами) в гистологических срезах и цитологических препаратах.

Понятия «иммуногистохимия» и «иммуноцитохимия», по существу, должны считаться синонимами. Однако на практике нередко под иммуногистохимическими подразумевают методы, используемые для определения искомых антигенов в тканевых срезах, тогда как реакции с антигенами, выявляемыми в цитологических препаратах, называют иммуноцитохимическими. Следует заметить, что принципиальных различий в теоретических основах и практическом применении этих методов нет. В дальнейшем в настоящей книге будет использоваться термин «иммуногистохимия» и только в тех случаях, когда это будет необходимо в соответствии с контекстом, – «иммуноцитохимия».

Современные методы иммуногистохимии и иммуноцитохимии разработаны на основе достижений иммунологии и молекулярной биологии и совершенствуются в соответствии с потребностями патогистологической диагностики, сохраняя свое значение важного инструмента научных исследований. Первые методы окраски гистологического препарата основывались на избирательном связывании красителей с компонентами клетки. Особую область гистологической техники составили методы импрегнации биологических объектов солями металлов. До середины ХХ века при разработке новых методов окраски часто использовался эмпирический подход. Быстрое развитие биохимии позволило создать ряд селективных методов выявления различных внутриклеточных субстанций и компонентов межклеточного вещества. В связи с достаточно понятными механизмами взаимодействия участвующих при их постановке реакций химических веществ эти методики получили название «гистохимические реакции». Однако гистохимические методы, как правило, не позволяют точно определять конкретные вещества, не всегда обладают высокой чувствительностью и нередко требуют специальных методов обработки материала, усложняющих гистологическое исследование. Таким образом, несовершенство существующих методик окраски закономерно привело к созданию нового направления науки, которое получило название «иммуногистохимия». Первые иммуногистохимические методы не отличались высокой чувствительностью, но благодаря высокой специфичности сразу стали использоваться в диагностических целях.

В настоящее время основными задачами иммуногистохимии можно считать разработку и теоретическое обоснование новых методов молекулярного анализа внутриклеточных структур, изучение продуктов экспрессии генов, изучение пролиферации и гибели клеток, гистотипирование опухолей (часть молекулярной и клеточной диагностики) и методическое обеспечение иммуноморфологии – области гистологии, в которой используются иммуногистохимические методы для изучения тканевой организации, развития тканей и клеточной дифференциации.

Основателем нового направления в науке и диагностике и автором первых методов иммуноцитохимии по праву считают американского врача-патолога и иммунолога Альберта Хьюитта Кунса (1912 – 1978). Под его руководством в 1941 г. были впервые получены меченные флюорохромом антитела, которые были успешно применены в диагностических целях на замороженных срезах (Coons A. H. [et al.], 1941; 1942; 1950). Визуализация результатов реакции производилась во флуоресцентном микроскопе. Однако сначала метод не получил широкого распространения из-за трудности получения антител, сложности их визуализации и низкой воспроизводимости результатов. В последующем методы визуализации комплекса «антиген – антитело» совершенствовались, увеличивались их чувствительность и воспроизводимость. Параллельно с этим разрабатывались новые методы очистки первичных антител, которые повышали специфичность иммуногистохимических реакций. С появлением новой технологии получения моноклональных антител (K?hler G. [et al.], 1975) иммуногистохимические методы получили широкое распространение в патогистологической диагностике в онкологии, поскольку наряду с высокой специфичностью и хорошей воспроизводимостью они обладают большей доступностью для стандартизации, без которой не может существовать ни один диагностический тест.

В нашей стране в настоящее время иммуногистохимические методы достаточно широко используются при патогистологической диагностике онкологических заболеваний (Петров С. В. [и др.], 2004). Морфологические диагностические подходы, основанные на использовании методов иммуногистохимии постепенно внедряются и в судебно-медицинской экспертизе (Коржевская В. Ф. [и др.], 2011).

Литература

Коржевская В. Ф., Сухорукова Е. Г., Кирик О. В. [и др.]. Особенности судебно-гистологического исследования головного мозга при смерти от тупой травмы головы. – СПб.: Изд-во СПбМАПО, 2011. – 35 с.

Петров С. В., Райхлин Н. Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. – Казань, 2004. – 456 с.

Coons A. H., Creech H. J., Jones R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – Vol. 47. – P. 200–202.

Coons A. H., Creech H. J., Jones R. N. [et al.]. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by use of fluorescent antibody // J. Immunol. – 1942. – Vol. 45. – P. 159–170.

Coons A. H., Kaplan M. H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. Biol. Med. – 1950. – Vol. 91, № 1. – P. 1–13.

K?hler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells producing antibody of pre-defined specificity // Nature. – 1975. – Vol. 256, № 5517. – P. 495–497.

Глава 2.

ПЕРВИЧНЫЕ АНТИТЕЛА

2.1. Антитела – компоненты сыворотки крови

Антитела – это растворимые гликопротеины глобулиновой фракции сыворотки крови и других биологических жидкостей, образующиеся в ответ на введение или проникновение антигена (чужеродных веществ, в том числе бактерий, вирусов, токсинов) в организм теплокровных животных (Ройт А. [и др.], 2000). На сегодняшний день антитела являются наиболее важными реагентами для использования в фундаментальных и прикладных исследованиях, что обусловлено их способностью к высокоспецифическому связыванию с антигеном, вызвавшим их образование.

Применяя определенные методические приемы, можно добиться образования антител к практически неограниченному набору антигенов. Однако стоит отметить, что стоимость коммерческих антител и затраты на их получение в условиях лаборатории могут различаться в десятки раз в зависимости от требуемой чистоты, специфичности и области применения, поэтому еще на этапе планирования исследования стоит уделить особое внимание правильному подбору антител. В этом может помочь и данное руководство.