Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

Сразу же после окончания фиксации зафиксированные кусочки лучше пропитать и залить (в парафин, целлоидин либо другие среды). Если нет возможности сразу залить фиксированный препарат, то он переносится в терпинеол или 80 %-й этанол, в которых материал может длительно сохраняться без нарушения способности к окраске и резке (Ромейс Б., 1954).

Артефактами спиртовой фиксации являются сильное сморщивание клеток и смещение клеточного и ядерного содержимого, а иногда и самих ядер к середине кусочка (по направлению проникновения фиксатора в объект).

1.2.3. Сложные фиксирующие жидкости, содержащие этанол

Сочетание этанола с другими фиксирующими веществами часто используется в научных исследованиях, поскольку позволяет в значительной мере уменьшить отрицательные свойства индивидуальных фиксирующих агентов и ускорить процесс фиксации и последующей проводки, так как в спиртовых растворах одновременно с процессом фиксации начинается обезвоживание тканей.

Сочетание этанола с формальдегидом. Существует несколько вариантов прописи фиксатора, состоящего из этанола и формалина (или параформальдегида). Чаще всего используют 5 – 10 %-й раствор формалина на основе спирта различной крепости (от 70 %-го до абсолютного). Для иммуноцитохимических исследований рекомендуется использовать 1 – 2 %-й раствор формалина (или 0,5 – 0,7 %-й раствор параформальдегида) на 80 %-м этаноле.

Для приготовления 100 мл фиксатора берут 98 мл 80 %-го этанола и 2 мл концентрированного формальдегида. Если используется сухой параформальдегид, фиксатор удобнее готовить следующим образом. Заранее готовится 4,0 %-й водный раствор параформальдегида, который может длительно сохраняться. Для этого параформальдегид растворяют в дистиллированной воде при нагревании (проще всего закрытую емкость оставить в термостате при 37 или 56 °C на 1 – 3 сут, несколько раз перемешивая раствор в течение дня). На каждые 80 мл 96 %-го этанола добавляют по 15 мл полученного водного раствора параформальдегида.

Продолжительность фиксации для иммуноцитохимии – 18 – 24 ч, для обычных окрасок – до 48 ч при комнатной температуре. После фиксации материал в воде не промывают. Обезвоживание можно начинать с 90 – 96 %-го спирта (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Абсолютный спирт с добавлением ледяной уксусной кислоты (например, 20 мл кислоты на 100 мл спирта) быстро проникает в ткани, так что в нем могут профиксироваться за несколько часов и кусочки несколько более крупные, чем в абсолютном спирте. Способ употребления и результаты сходны с теми, которые характерны при использовании абсолютного спирта. После фиксации материал переносят еще на короткий срок в чистый абсолютный спирт. Затем следует заливка (Ромейс Б., 1954).

Жидкость Карнуа. Эта фиксирующая жидкость хорошо сохраняет структуру ядра клетки и часто применяется при необходимости быстрой фиксации и ускоренной проводки. Фиксатор готовится менее чем за 1 ч до начала фиксации. Фиксатор состоит из абсолютного спирта (можно заменить и 96 %-м), хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношениях 6: 3: 1. При фиксации в жидкости Карнуа следует вырезать кусочки толщиной не более 4 мм. Продолжительность фиксации составляет 3 – 4 ч. Длительное пребывание объектов в фиксаторе в большинстве случаев нежелательно. После жидкости Карнуа материал обезвоживают в абсолютном этаноле, после чего можно сразу приступать к заливке. В случае необходимости после фиксации и обезвоживания материал можно длительно хранить в метилсалицилате (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Спирт-цинковый фиксатор по Рейману и Унна (1912) состоит из 2 % раствора хлористого цинка в 96 %-м этаноле. Этот фиксатор Б. Ромейс рекомендует для лучшего выявления цитоплазмы клеток.

Этанол-уксусная кислота. Смесь 96 %-го этанола с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3: 1 в англоязычной литературе иногда называют жидкостью Карнуа I, а обычную жидкость Карнуа – Карнуа II. Условия фиксации материала аналогичны условиям фиксации в жидкости Карнуа.

Спирт-формалин-уксусная кислота (СФУ). Существует несколько вариантов фиксирующих растворов, в которые входят помимо этанола формалин и ледяная уксусная кислота. Все они считаются (Лилли Р., 1969) хорошими фиксаторами для цитоплазматических структур и являются оптимальными для стабилизации гликогена в тканях. Фиксирующие растворы готовятся в день взятия материала, поскольку их качество изменяется с течением времени. СФУ по Лилли состоит из 85 мл 96 %-го этанола, 10 мл концентрированного (35 – 40 %) формальдегида и 5 мл ледяной уксусной кислоты. Для лучшей стабилизации гликогена рекомендуется фиксировать материал при 0 – 5 °C в течение 24 ч. После фиксациидальнейшую проводку можно начинать с 96 %-го этанола. СФУ по Теллесницкому готовится из 100 мл 70 %-го этилового спирта, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 5 мл концентрированного формальдегида. Продолжительность фиксации объектов – 18 – 24 ч. После фиксации проводку следует начинать с 80 %-го этанола. В нем объекты могут быть оставлены и для длительного хранения, поскольку тинкториальные свойства не изменяются.

1.2.4. Метанол

Метанол является высокотоксичным соединением и поэтому редко используется в гистологической практике. Однако абсолютный метанол является лучшим фиксатором для мазков крови и красного костного мозга. Традиционно его рекомендуют и для фиксации других цитологических объектов. Фиксацию мазков в метаноле осуществляют следующим образом: в герметично закрытый стакан с абсолютным метанолом помещают предметные стекла с мазками на 5 – 10 мин, затем их извлекают и просушивают (Артишевский А. А. [и др.], 1999).

Метанол-уксусная кислота. В последнее время большое распространение получил фиксатор, состоящий из метанола и уксусной кислоты в соотношении 3: 1 (мета-Карнуа). Он рекомендован для фиксации объектов, в которых планируется выявлять аргентофильные белки ядрышкового организатора (Ag-NOR). Сроки фиксации аналогичны срокам, рекомендованным для жидкости Карнуа (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Р. Лилли (1969) приводит сведения о фиксаторе метанолхлороформ (2: 1; время фиксации – 12 – 48 ч), который рекомендуется для экстракции липидов из нервной ткани при комбинированной заливке в целлоидин-парафин. При использовании метанол-хлороформа возможно получение срезов толщиной 2 мкм.

1.2.5. Изопропанол

Изопропанол не применяется в гистологии в качестве самостоятельного фиксирующего вещества в связи с плохим проникновением в ткани. Однако он может быть использован в комбинации с другими веществами в составе сложных фиксаторов. В качестве примера можно привести жидкость Ньюкомера и цинк-ацетонизопропанол-формальдегид (Коржевский Д. Э. [и др.], 2006).

Жидкость Ньюкомера дает примерно такие же результаты фиксации, как и жидкость Карнуа. Этот фиксатор состоит из 60 мл изопропанола, 30 мл пропионовой кислоты, 10 мл ацетона и 10 мл диоксана. Образцы тканей следует фиксировать 12 – 24 ч при комнатной температуре и затем хранить при 3 °C в свежей порции фиксатора. Для промывки после фиксации и обезвоживания следует использовать изопропанол (Лилли Р., 1969).

1.2.6. Уксусная кислота

Уксусная кислота сама по себе употребляется для фиксации очень редко, так как в чистом виде она дает плохие результаты. Очень часто ее прибавляют к другим фиксирующим жидкостям. Ледяной уксусной кислотой называют 100 %-ю уксусную кислоту, концентрированная уксусная кислота содержит 4 % воды. Фиксирующее действие уксусной кислоты распространяется в основном на структуры клеточного ядра и хромосомы.

Уксусная кислота – орсеин. 1 г орсеина растворяют в 45 мл горячей уксусной кислоты, охлаждают и добавляют 55 мл дистиллированной воды. Полученный реактив обладает одновременно фиксирующими и окрашивающими свойствами. Он хорошо окрашивает гетерохроматин и хромосомы в цитологических препаратах (Лилли Р., 1969).

1.2.7. Формалин

Формалин – наиболее распространенная и универсальная фиксирующая жидкость. Формалин хорошо проникает в ткани и потому применяется для фиксации довольно крупных объектов. Формалин придает ткани плотность, вполне подходящую для резки на замораживающем микротоме и вибратоме. Существенное преимущество формалина состоит в том, что препараты можно хранить в нем годами, у них сохраняется способность к окрашиванию наиболее часто используемыми методами (гематоксилинэозином, по Ван-Гизону). Особенно ценной является способность формалина хорошо сохранять липиды, что важно для фиксации нервной ткани. Фиксация чистым формалином менее пригодна для различных цитологических исследований, например для ядерных структур, для органов кроветворения, для обнаружения гликогена или железа. Недостатками формалина являются:

– ухудшение окраски тканей при продолжительной фиксации и хранении «влажного архива»;

– возможность выпадения формалиновых осадков;

– сильное маскирующее действие на большинство антигенов, выявляемых иммуноцитохимически.

Для приготовления формалинового фиксатора используют готовый 35 – 40 % водный раствор формальдегида (альдегида муравьиной кислоты). Следует учитывать, что концентрированный раствор формальдегида обычно содержит метиловый спирт (около 10 %), который добавляют для стабилизации раствора и предотвращения полимеризации формальдегида. Формалин следует хранить в защищающих от света коричневых склянках при температуре не ниже 9 °C. При более сильном охлаждении в растворе появляется муть, которая постепенно оседает в виде белого осадка (параформальдегид и триоксиметилен). При длительном хранении раствор формальдегида медленно окисляется, происходит накопление муравьиной кислоты.

В большинстве случаев препараты удовлетворительного качества можно получить при использовании в качестве фиксирующей жидкости обычного (кислого, не нейтрализованного) 10 %-го формалина. Его готовят из концентрированного раствора формальдегида, добавляя к одной его части 9 частей водопроводной воды. Не следует использовать формальдегид с белым осадком. Часто рекомендуемый способ растворения осадка путем нагревания в вытяжном шкафу на практике мало применим. При появлении незначительного осадка в емкости с концентрированным раствором формальдегида следует уменьшить его разведение (1: 6 вместо 1: 9). При наличии значительного осадка раствор формальдегида становится непригодным для использования (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Определение концентрации формалина в растворе представляется затруднительной задачей. Существующий метод титрования описан у Б. Ромейса (1954), однако он чрезвычайно сложен и поэтому не может быть рекомендован для практических целей. Упростить решение этой задачи позволяет специальная индикаторная бумага, выпускаемая фирмой Sakura (Япония).

При необходимости использования нейтрального раствора формалина (для фиксации нервной ткани, при применении специальных окрасок, при проведении иммуноцитохимического исследования) его готовят следующим образом: раствор формальдегида (37 – 40 %) – 100 мл, вода дистиллированная – 900 мл, однозамещенный фосфат натрия – 4 г, безводный двузамещенный фосфат натрия – 6,5 г. Этот раствор стабилен при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Использование нейтрального формалина позволяет существенно уменьшить вероятность отложения формалиновых осадков, появление которых обусловлено взаимодействием гемоглобина с кислыми растворами формалина (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Нейтрализация формалина по Б. Ромейсу. Формалин оставляют надолго в коричневой склянке над слоем порошкообразного углекислого кальция толщиной 1 – 2 см. Вначале склянку несколько раз энергично взбалтывают. Обычно кислота достаточно нейтрализуется уже через 24 ч.

Если нейтрализация формалина не производится, то его следует развести до нужной концентрации заранее, а не в день фиксации. Этот прием улучшает качество фиксации.

Кусочки органов толщиной 0,5 – 1,0 см фиксируются в 10 – 20 %-м растворе формалина в течение 24 – 48 ч. Спустя сутки раствор меняют. Более длительная фиксация нежелательна. Критерием достаточной фиксации служит равномерное уплотнение объекта как с поверхности, так и выявляемое на контрольном разрезе. В центральной части не полностью фиксированных кусочков ткань сохраняет красно-розовый цвет. Фиксацию в формалине проводят при комнатной температуре (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Формалин-пиридин. Рекомендуется следующий раствор: дистиллированная вода – 75 мл, формалин – 25 мл, чистый пиридин – 5 мл. Количество фиксирующей жидкости должно превышать объем препарата по крайней мере в 20 раз. Продолжительность фиксации – 48 ч. Периферические нервы лучше фиксировать 2 нед. (допустимо и 6 нед.), не должно быть никаких осадков формалина. После этой фиксации применимы все обычные методы окраски и импрегнации. Этот метод фиксации рекомендован для тех случаев, когда предписывается нейтральный формалин. рН формалин-пиридина – около 7,0 – 7,5 (Ромейс Б., 1954).

Формалиновые осадки. Очень часто в фиксированных формалином препаратах появляются темно-коричневые кристаллические осадки, которые образуются в результате взаимодействия формальдегида с гемоглобином (Ромейс Б., 1954). Чаще всего они обнаруживаются в области кровоизлияний и над просветами кровеносных сосудов, заполненных эритроцитами. По цвету формалиновые осадки невозможно отличить от скоплений гемосидерина, что затрудняет диагностическую оценку препарата.

Метод Кардазевича. Удаление осадков лучше всего производится путем помещения неокрашенных срезов в 1 – 5 % раствор нашатырного спирта (NН

ОН) в 70 %-м этиловом спирте. Время исчезновения осадков варьирует от 5 мин до 4 ч. Cтруктура и окрашиваемость объекта остаются неизмененными. Этот метод превосходит часто употребляющийся метод Верокая. Единственный недостаток этого способа состоит в том, что, кроме формалинового осадка, растворяется и малярийный пигмент. Остальные пигменты, прежде всего липофусцин, меланин, гемосидерин, антракотический пигмент, не растворяются (Ромейс Б., 1954).

Метод Верокая. Для освобождения от формалиновых осадков срезы помещают на 10 мин в смесь 1 части 1 %-го водного раствора едкого калия и 100 частей 80 %-го спирта, затем на 5 мин – в дважды сменяемую воду, на 5 мин – в 80 %-й спирт, после чего промывают в проточной воде (Ромейс Б., 1954).

Размягчение перефиксированных препаратов. Если вследствие длительного пребывания в крепком формалиновом растворе препараты станут слишком плотными, то избыточную плотность можно устранить помещением их на 14 дней в 1 %-й раствор азотнокислого серебра или в 10 %-й раствор лимонной кислоты (Ромейс Б., 1954).

Формалин часто комбинируют с другими фиксирующими жидкостями, причем непосредственно перед употреблением, так как жидкости, особенно если они содержат окислители, после смешения достаточно быстро изменяют свои свойства из-за окисления формальдегида.

1.2.8. Пикриновая кислота и жидкость Буэна

Пикриновая кислота (тринитрофенол) – желтое кристаллическое вещество, слаборастворимое в воде и хорошо растворимое в органических растворителях. В сухом виде пикриновая кислота взрывоопасна. В увлажненном состоянии и в водных растворах она не способна к детонации. В лаборатории не следует хранить сухую пикриновую кислоту. Она очень часто применяется в технике фиксации, особенно в соединении с другими веществами, такими как формалин, ледяная уксусная кислота, азотная кислота, сулема, в чистом виде – сравнительно редко.

Из многочисленных смесей, содержащих пикриновую кислоту, на первом месте по комплексу показателей (качество фиксации, простота приготовления, отсутствие эффекта перефиксации) стоит жидкость Буэна, состоящая из пикриновой кислоты, формалина и ледяной уксусной кислоты. Способность тканей к окраске очень хорошо сохраняется во всех пикриновокислых смесях. При исследовании на содержание кальция нужно учитывать, что пикриновая кислота оказывает слабое декальцинирующее действие (Ромейс Б., 1954).

В фиксационной технике пикриновая кислота употребляется обычно в виде насыщенного водного раствора, к которому перед употреблением прибавляют другие жидкости. По Б. Ромейсу, для приготовления запасного раствора, который может сохраняться очень долго, всыпают 30 – 50 г пикриновой кислоты в бутылку объемом 1 – 2 л, наполняют ее подогретой дистиллированной водой, энергично взбалтывают и дают остыть. При комнатной температуре в 100 мл воды растворяется около 1,2 г кислоты, так что в остывшем растворе на дне осаждается большой избыток нерастворенных кристаллов. Если раствор использован, то к осадку снова добавляют горячую воду. Чтобы всегда был запас, лучше всего иметь две запасные емкости с пикриновой кислотой.

Отмывка пикриновой кислоты производится почти исключительно 70 – 80 %-м спиртом, но не водой, так как вызванные пикриновой кислотой осадки большей частью нерастворимы в воде. Кроме того, при помещении в воду наступает набухание соединительной ткани. При отмывке следует несколько раз сменить спирт, однако обычно нет необходимости полностью вымывать пикриновую кислоту (Ромейс Б., 1954).

Желтая окраска срезов после регидратации может быть устранена обработкой в 5 %-м водном растворе тиосульфата натрия.

Пикриновая кислота – формалин-уксусная кислота. Эта предложенная Буэном смесь принадлежит к лучшим фиксирующим жидкостям. Относительно быстро проникающий фиксатор рекомендуется как для обзорных препаратов, так и для специальных исследований. Жидкость Буэна пригодна и для фиксации эмбрионов. Окрашиваемость тканей очень хорошая. Коллагеновые волокна в ней несколько набухают; жиры и липоидные вещества сохраняются хуже. Считается, что жидкость Буэна недостаточно хорошо фиксирует ткани почки (Меркулов Г. А., 1969).

Жидкость Буэна. Фиксатор готовится ex tempore из насыщенного 1,2 %-го водного раствора пикриновой кислоты, концентрированного формальдегида (35 – 40 %) и ледяной уксусной кислоты в соотношении 15: 5: 1. Продолжительность фиксации – около 24 ч при комнатной температуре. Возможно и более длительное (до нескольких суток) пребывание срезов в жидкости Буэна без ухудшения качества последующей окраски. После фиксации полагаются короткая промывка в воде (1 – 15 мин) и более длительная (до суток) – в 70 %-м этаноле, обезвоживание и заливка в парафин. Заливка в целлоидин нежелательна. После фиксации в жидкости Буэна срезы ярко окрашиваются кислыми красителями (эозином и др.) и несколько хуже воспринимают основные анилиновые красители. В связи с этим для окончательного удаления пикриновой кислоты после депарафинирования рекомендуют обработать срезы в 0,2 %-м водном растворе карбоната лития в течение 30 с (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

При заливке в целлоидин материала, фиксированного по Буэну, часто обнаруживается, что даже после длительного пребывания в растворе целлоидина препараты пропитываются не полностью и крошатся при резке. Для устранения этого недостатка рекомендуется после 96 %-го спирта переносить препараты на 10 – 48 ч в следующую масляную смесь: 10 мл кедрового масла, 80 мл абсолютного спирта, 20 мл ориганового масла, 10 мл азотной кислоты. После этого объекты снова помещают на 24 – 48 ч в 96 %-й спирт, который сменяют 2 – 3 раза. Далее проводят те же манипуляции, как при целлоидиновой заливке. После такой обработки препараты хорошо режутся и не крошатся. Предполагается, что хрупкость объектов обусловлена образованием пикрата калия, который препятствует проникновению целлоидина; масляная смесь, содержащая азотную кислоту, растворяет и удаляет его (Ромейс Б., 1954).