Фармакология взаимодействия регуляторных пептидных систем головного мозга в механизмах подкрепления
Металлические направляющие канюли из нержавеющей стали диаметром 0,2 мм вживляли униполярно в правый желудочек мозга одновременно с электродами, вводимыми в латеральный гипоталамус, по следующим координатам (рис.2): АР = 0,8 мм назад от брегмы, SD = 1,4 мм латерально от сагитального шва, Н = 3,8 мм от поверхности черепа согласно атласу K. P. König и A. A. Klippel (1963).
А
Б
Рис. 2. Морфологическая картина зон микроинъекций веществ в центральное ядро миндалины (А) и ядро ложа конечной полоски (Б)
Координаты по атласу К. Кёнига и А. Клиппеля (1963). Показаны фронтальные срезы в мм относительно брегмы.
Канюли фиксировали на черепе животного самотвердеющей пластмассой и после операции закрывали специальным колпачком, который временно снимали для введения веществ в структуру мозга.
При внутриструктурном введении веществ в направляющие вставляли металлические микроканюли диаметром 100 мкм, кончик которых был на 0,2 мм длиннее направляющей.
Поведенческие эксперименты начинали не ранее 10 дней после операции. По окончании всех опытов производили морфологический контроль локализации кончиков электродов на серии фронтальных срезов мозга, которые окрашивали по методу Ниссля, предварительно производили коагуляцию через вживленные электроды током силой 1 мА в течение 30 с. (рис.4).
Рис. 4. Фронтальный срез головного мозга крысы.
Стрелкой указана область вживления электрода в латеральный гипоталамус.
2.3. Методы самораздражения мозга у крыс
Для воспроизведения самораздражения мозга у крыс использовали классический вариант изучения самостимуляции мозга в виде педальной самостимуляции в камере Скиннера. Через 10 дней после вживления электродов в мозг крыс обучали нажимать на педаль в камере Скиннера для получения электрического раздражения мозга (прямоугольные импульсы отрицательной полярности, длительностью 1 мс, с частотой 100 Гц, в течение 0,4 с, пороговыми значениями тока в режиме «фиксированных пачек»– FR1). Для повторного раздражения животное было вынуждено вновь нажимать на педаль. Анализировали частоту и пороги реакции самостимуляции. Фармакологические препараты вводили на 3-й день эксперимента после стабилизации реакции при использовании фиксированного значения силы тока. Частота нажатий регистрировалась автоматически (рис.5).
Рис. 5. Реакция педальной самостимуляции у крыс в камере Скиннера
Два верхних фото демонстрируют нативную методику самостимуляции,
внизу – схематическое изображение методики.
Регистрировали число нажатий на педаль в течение 10 мин эксперимента, затем производили внутриструктурную микроинъекцию препарата и через 15-20 мин повторно регистрировали число нажатий на педаль за 10-минутный интервал времени. В дополнительных сериях экспериментов исследовали порог возникновения реакций нажатия на педаль. После определения значений силы тока, когда наблюдаются первые изменения в поведении животного, производили ступенчатое повышение тока с шагом в 5 мкА. В камере Скиннера подавали ток в навязанном режиме (серии прямоугольных импульсов отрицательной полярности, длительностью 1 мс, с частотой 100 Гц, в течение 0,4 с, интервалы между сериями импульсов 0,5 с) нарастающими порциями (primingstimulation) с интервалом 30 с длительностью по 5 с до появления стойких нажатий педали. Процедуру поиска пороговых значений силы тока повторяли 2 раза. Затем повышали силу тока на 10% от пороговых значений, когда наблюдали выраженную реакцию самостимуляции, и снижали ток порциями (шаг 5 мкА длительностью 30 с) до появления отказа от нажатий педали. Процедуру поиска пороговых значений силы тока также повторяли 2 раза. При совпадении значений силы тока, полученных с использованием нарастающего и снижающего режимов, его считали порогом реакции самостимуляции. Затем производили внутриструктурную микроинъекцию препарата, и через 15-20 мин повторно производили поиск порога реакции самостимуляции.
При изучении подкрепляющих свойств электрической стимуляции мозга в ряде случаев использовался свободный режим подкрепления, когда электрическая стимуляция мозга длится все время нажатия педали (Лебедев А. А., Шабанов П. Д., 1992). Использование данного режима предполагает повышенный уровень нагрузки на подкрепляющие механизмы головного мозга и дает возможность выявлять отрицательную эмоциональную составляющую реакции самостимуляции, которая обычно следует после 0,5 секунды начала раздражения и заставляет животное отжимать педаль, как бы избегать ее (Звартау Э. Э., 1988; Вартанян Г. А., Петров Е. С., 1989).
2.4. Условное предпочтение места
Опыты с условной реакцией предпочтения места проводили в прямоугольной двухкамерной экспериментальной установке размером 35*35*30 см, стороны которой различались цветом (темный и светлый) и текстурой пола и были разделены перегородкой с опускающейся и поднимающейся дверцей. В течение первых двух дней эксперимента животных помещали в установку с целью их адаптации. В первый тестовый день регистрировали время нахождения животного в каждом отсеке в течение 10 мин для определения исходного предпочтения. Отсек считался предпочитаемым, если животное проводило в нем больше 50% времени. В последующие 6 дней обусловливания дверцу между отсеками закрывали. В традиционном варианте животные получают через день инъекцию препарата непосредственно перед помещением в исходно непредпочитаемый отсек на 60 мин и инъекцию физиологического раствора перед помещением в исходно предпочитаемый отсек; животные контрольной группы получают только физиологический раствор. В условиях наших опытов в качестве средства инициации предпочтения использовали грелин (или орексин), вводимый внутрижелудочково. Во второй тестовый день дверцы открывали и повторно измеряли время нахождения в каждом из отсеков в течение 10 мин. Животные контрольной группы получали только физиологический раствор.
2.4.1. Методика выработки условного предпочтения места
Животному делается укол без введения каких-либо веществ, затем через 5 минут оно помещается в предпочитаемое поле на 30 мин. После часа перерыва тому же животному вводится препарат, вызывающий предпочтение места совместно с исследуемым веществом, и через 5 минут оно помещается в непредпочитаемое поле камеры на 30 минут. Таким образом втечение пяти дней подряд мы проводим группу животных, пытаясь вызвать у них стойкое предпочтение, ранее непредпочитаемого поля. На шестой день мы сажаем то же животное (уже не вводим никаких препаратов) в камеру с открытой дверцей между полями на 10 мин. Далее определяем время нахождения животного в каждом отсеке и число переходов между ними. Результаты считаются положительными, если на шестой (контрольный) день у животного не выработалось предпочтение места.
2.4.2. Методика экспрессии выработанного предпочтения места
Животному делается укол без введения каких-либо веществ, затем через 5 минут оно помещается в предпочитаемое поле на 30 мин. После часа перерыва тому же животному вводится препарат, вызывающий предпочтение места, и через 5 минут оно помещается в непредпочитаемое поле камеры на 30 минут. Таким образом втечение пяти дней подряд мы проводим группу животных, вызывая у них стойкое предпочтение, ранее непредпочитаемого поля. На шестой день мы помещаем животное в камеру с открытой дверцей между полями, не вводя при этом никаких препаратов. При правильном выполнении методики мы получаем предпочтение животными ранее непредпочитаемого поля. На седьмой день мы НЕ вводим препарат, вызывающий предпочтение места, а используем исследуемое вещество, вероятно блокирующее выработанное, в ходе методики, предпочтение. Поднимаем дверцу между полями и сажаем животное в камеру на 10 мин. Далее определяем время нахождения в каждой камере и число перебегов между ними. Результаты считаются положительными если время нахождения в отсеке с введением препарата, вызывавшего предпочтение места, снижается после введения исследуемого вещества (относительно контрольной группы без введения интересующего нас препарата).
2.4.3. Влияние типа покрытия поля на эффект фенамина
Препарат
Колличество времини в другом поле (с.)
Колличество времини в поле, в котором вводились препараты (с.)
Колличество перебегов между полями (среднее)
Фенамин 1мг/кг, в/б на поле с решеткой
175,4 ± 44
424,6±44*
7±2
Фенамин 1мг/кг, в/б на гладком поле
183±45
417±46*
7,5±3
Вывод: в ходе эксперимента мы выяснили, что тип покрытия отсека в опыте с предпочтением места не влияет на эффект фенамина и в анализе следующих данных учитываться не будет.
2.5.Фармакологические вещества, используемые для анализа
эмоциональных форм поведения
Для фармакологического анализа использовали психомоторный стимулятор фенамин (1 мг/кг), который вводили внутрибрюшинно за 30 мин до изучения самостимуляции (после определения фоновых ее значений), а в опытах условного предпочтения места непосредственно перед помещением в исходно непредпочитаемый отсек. Астрессин (неизбиральный антагонист рецепторов КРГ), грелин, орексин, а также их антагонисты: синтетический антагонист OX1R рецепторов орексина – SB-408124, рекомбинантный антагонист OX1R рецепторов – Orexin B18-28, пептидный антагонист грелина – [D-Lys3]-GHRP-6. Все препараты в трех дозировках по 0,1; 1; 10 мкг (Sigma, США) вводили внутриструктурно в желудочек мозга через вживленную канюлю. Субстанции веществ растворяли в дистиллированной воде и вводили в объеме 1 мкл с помощью микроинъектора СМА-100 (Швеция) в течение 30 с за 10-15 мин до тестирования после определения исходных значений самораздражения латерального гипоталамуса.
2.6. Статистическая обработка полученных материалов
Выборка для каждого вещества составила не менее 10-12 опытов. Для статистической обработки полученных количественных данных и построения графиков применяли пакеты программ GraphPadPrizmv.5, SPSSSigmaStat 3.0 и Minitab 14. Для оценки соответствия распределений случайных величин гауссовым применяли критерий нормальности Колмогорова–Смирнова. Для сравнения контрольной и экспериментальных групп использовали непараметрический критерий Вилкоксона для парных сравнений.
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1.Исследование эффектов введения антагонистов орексина в желудочки мозга для подкрепляющих свойств психоактивных веществ
Крысам самцам Вистар вживляли биполярные электроды в латеральный гипоталамус для исследования реакции самостимуляции вкамере Скиннера и микроканюли в левый боковой желудочек для изучения центральных эффектов действия антагониста орексина SB-408124 (1 мкл на инъекцию) на подкрепляющие свойства фармакологических веществ. Исследования показали, что при системном введении фенамин (1 мг/кг, в/бр) на 32% повышал частоту нажатий педали в камере Скиннера (т.е. число нажатий педали за 10 мин) при регистрации реакции самостимуляции латерального гипоталамуса (табл. 1,2,3). А введение антагонистов орексина в обоих дозах (1мкг/мкл;10 мкг/мкл) в желудочек мозга снижало эффекты фенамина (число нажатий на педаль) (табл. 1,2).
Табл. 1. Действие фенамина при внутрибрюшинном введении, антагониста орексина SB-408124 (1мкг), рекомбинантного антагониста OX1R рецепторов Orexin B18-28 (1мкг) при внутрижелудочковом введении и их комбинации на реакцию самостимуляции у крыс.
Вещество, доза
Число нажатий на педаль за 10мин
Пороги самостимуляции
(мкА)
До введения
После введения
До введения
После введения
Фенамин 1мг/кг, в/б
144,5±19
100%
216,25±26*
132%
143,25±18
100%
125±22
85,9%
SB-408124 1мкг/мкл, в/ж
78±10
100%
76±9
101%
89±11
100%
88±11
99%
Фенамин 1мг/кг, в/б + SB-408124 1мкг/мкл, в/ж
116,5±15
100%
129,75±18
115%
80±10
100%
68,5±12
96,8%
Orexin B18-28 1мкг/мкл, в/ж
125,9±16
100%
123,3±16
98,8%
121.3±15
100%
120±15
100,1%
Фенамин 1мг/кг, в/б + Orexin B18-28 1мкг/мкл, в/ж
264,4±33
100%
278,5±35
113,4 %
214,4±28
100%
212,5±30
103,8%
Напротив, оба антагониста орексина (1 мкг, в/ж) достоверно не меняли основных показателей при регистрации реакции самостимуляции в камере Скиннера (как числа нажатий на педаль, так и порогов реакции самостимуляции). При введении SB-408124 (1мкг, в/ж) с фенамином (1мг/кг, в/б), наблюдается снижение эффектов фенамина. Так число нажатий на педаль за 10 минут, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижается со 132% до 115%, а пороги самостимуляции повышаются с 85,9% до 96,8%. При введении антагониста орексина Orexin B18-28 (1мкг, в/ж) с фенамином (1мг/кг, в/б), также наблюдается снижение эффектов фенамина. Число нажатий на педаль за 10 минут, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижается со 132% до 113,4%, а пороги самостимуляции повышаются с 85,9% до 103,8%.
Табл. 2. Действие фенамина при внутрибрюшинном введении, антагониста орексина SB-408124 (10мкг), Orexin B18-28 (10мкг) при внутрижелудочковом введении и их комбинации на реакцию самостимуляции у крыс.
Вещество, доза
Число нажатий на педаль за 10мин
Пороги самостимуляции
(мкА)
До введения
После введения
Довведения
После введения
Фенамин 1мг/кг, в/б
144,5±19
100%
216,25±26*
132%
143,25±18
100%
125±22
85,9%
SB-408124 10 мкг/мкл, в/ж
118±13
100%
121±10
103%
62±8
100%
58,7±5
98%
Фенамин 1мг/кг, в/б + SB-408124 10 мкг/мкл, в/ж
86,5±7
100%
97,1±9
109,6%
110±14
100%
118,3±15
105,1%
Orexin B18-28 10 мкг/мкл, в/ж
93,9±10
100%
92,5±7
99,3%
141,7±11
100%
145±13
103%
Фенамин 1мг/кг, в/б + Orexin B18-28 10 мкг/мкл, в/ж
134,8±16
100%
145,5±10
106,4 %
82,5±8
100%
86,1±6
103%
В дозе 10мкг/мкл оба антагониста орексина достоверно не изменяли основных показателей при регистрации реакции самостимуляции в камере Скиннера (как числа нажатий на педаль, так и порогов реакции самостимуляции). Однако при введении SB-408124 (10мкг, в/ж) с фенамином (1мг/кг, в/б), наблюдается явное снижение эффектов фенамина. Так число нажатий на педаль за 10 минут, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижается со 132% до 109,6%, а пороги самостимуляции повышаются с 85,9% до 105,1%. При введении антагониста орексина Orexin B18-28 (10мкг, в/ж) с фенамином (1мг/кг, в/б), также наблюдается снижение эффектов фенамина. Число нажатий на педаль за 10 минут,относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижается со 132% до 106,4%, а пороги самостимуляции снижаются со 122,9% до 103%.
Табл. 3. Действие фенамина при внутрибрюшинном введении, SB-408124 (0,1мкг), Orexin B18-28 (0,1мкг) при внутрижелудочковом введении и их комбинации на реакциюсамостимуляции у крыс.
Вещество, доза
Число нажатий на педаль за 10мин
Пороги самостимуляции
(мкА)
До введения
После введения
Довведения
После введения
Фенамин 1мг/кг, в/б
144,5±19
100%
216,25±26*
132%
143,25±18
100%
125±22
85,9%
SB-408124 0,1 мкг/мкл, в/ж
103,6±10
100%
105,1±9
101%
94±10
100%
92±10
99%
Фенамин 1мг/кг, в/б + SB-408124 0,1 мкг/мкл, в/ж
126,4±16
100%
149,9±17
129%
90±10
100%
104±12
117,6%
Orexin B18-28 0,1 мкг/мкл, в/ж
95,7±12
100%
94,9±10
98,3%
85±10
100%
86,4±7
101 %
Фенамин 1мг/кг, в/б + Orexin B18-28 0,1 мкг/мкл, в/ж
154,7±21
100%
203,4±18
133 %
135±14
100%
154,6±18
118,3%
В дозе 0,1 мкг/мкл оба антагониста орексина достоверно не изменяли основных показателей при регистрации реакции самостимуляции в камере Скиннера (как числа нажатий на педаль, так и порогов реакции самостимуляции). При введении антагонистов орексина (0,1 мкг, в/ж) с фенамином (1мг/кг, в/б), не наблюдалось достоверное изменение эффектов фенамина (как числа нажатий на педаль, так и порогов реакции самостимуляции).
Опыты с условной реакцией предпочтения места проводили в прямоугольной двухкамерной экспериментальной установке размером 35*35*30 см, стороны которой различались цветом (темный и светлый) и текстурой пола и были разделены перегородкой с опускающейся и поднимающейся дверцей. Исследования влияния на выработку предпочтения места и экспрессию выработанного предпочтения места показали, что при внутрибрюшинном введении фенамин (1мг/кг) значительно повышал время нахождения животного в отсеке, в котором вводился препарат. На фоне блокады рецепторов орексина его антагонистами в дозах 1мкг и 10мкг эффект фенамина проявлялся в меньшей степени (табл. 4,5,6,7).
Табл. 4. Эффекты антагонистов орексина (1мкг/мкл) на фоне фенамина в реакции условного предпочтения места (влияние на выработку предпочтения места)
Препарат
Время в отсеке без введения препаратов (с.)
Время в отсеке с в введением препаратов (с.)
Число переходов из отсека в отсек
Фенамин1мг/кг, в/б
175,4 ± 44
424,6±44*
7±2
SB-408124 1мкг/мкл, в/ж+ 1мл физ. р-ра, в/б
296±15
304±15
10±2
SB-408124 1мкг/мкл, в/ж+ фенамин1мг/кг, в/б
285±26
315±27
11±3
Orexin B18-28 1мкг/мкл, в/ж +1мл физ.р-ра , в/б
306±13
294±13
13±5
Orexin B18-28 1мкг/мкл, в/ж+ фенамин1мг/кг, в/б
234±51
331±24*
11±3,5
Напротив, в опытах влияния препаратов на выработку предпочтения места SB-408124 (1мкг) и Orexin B18-28 (1мкг) при введении их внутрижелудочково достоверно не влияли на нахождение животного в отсеке. При введении SB-408124 (1мкг, в/ж) совместно с фенамином (1мг/кг, в/б) время нахождения в отсеке с введением препаратов, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижалось с 424,6с до 315с, а число переходов из отсека в отсек увеличилось с 7 до 11. При введении Orexin B18-28 (1мкг, в/ж) совместно с фенамином (1мг/кг, в/б) время нахождения в отсеке с введением препаратов, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижалось с 424,6с до 331с, а число переходов из отсека в отсек увеличилось так же с 7 до 11.
Табл. 5. Эффекты антагонистов орексина (1мкг/мкл) на фоне фенамина в реакции условного предпочтения места (влияние на экспрессию выработанного предпочтения места)
Препарат
Время в отсеке без введения препаратов (с.)
Время в отсеке с в введением препаратов (с.)
Число переходов из отсека в отсек
Фенамин1мг/кг, в/б
175,4 ± 44
424,6±44*
7±2
SB-408124 1мкг/мкл, в/ж+ 1мл физ. р-ра, в/б
301±15
299±15
10±4
SB-408124 1мкг/мкл, в/ж+ фенамин1мг/кг, в/б
271±24
329±27*
11±3
Orexin B18-28 1мкг/мкл, в/ж +1мл физ.р-ра , в/б
292±13
308±13
14±4
Orexin B18-28 1мкг/мкл, в/ж+ фенамин1мг/кг, в/б
217±17
382±19,6*
10±3
В опытах с влиянием препаратов на экспрессию выработанного предпочтения места SB-408124 (1мкг) и Orexin B18-28 (1мкг) при введении их внутрижелудочково достоверно не влияли на нахождение животного в отсеке. При введении SB-408124 (1мкг, в/ж) совместно с фенамином (1мг/кг, в/б) время нахождения в отсеке с введением препаратов, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижалось с 424,6с до 329с, а число переходов из отсека в отсек увеличилось с 7 до 11. При введении Orexin B18-28 (1мкг, в/ж) совместно с фенамином (1мг/кг, в/б) время нахождения в отсеке с введением препаратов, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижалось с 424,6с до 382с, а число переходов из отсека в отсек увеличилось так же с 7 до 10.
Табл. 6. Эффекты антагонистов орексина (10мкг/мкл) на фоне фенамина в реакции условного предпочтения места (влияние на выработку предпочтения места)
Препарат
Время в отсеке без введения препаратов (с.)
Время в отсеке с в введением препаратов (с.)
Число переходов из отсека в отсек
Фенамин1мг/кг, в/б
175,4 ± 44
424,6±44*
7±2
SB-408124 10мкг/мкл, в/ж+ 1мл физ. р-ра, в/б
303±16
297±16
11±2
SB-408124 10мкг/мкл, в/ж+ фенамин1мг/кг, в/б
282±21
318±20
8±2
Orexin B18-28 10мкг/мкл, в/ж +1мл физ.р-ра , в/б
301±10
299±9
6±2
Orexin B18-28 10мкг/мкл, в/ж+ фенамин1мг/кг, в/б
276±36
324±18
13±3
В опытах влияния препаратов на выработку предпочтения места SB-408124 (10мкг) и Orexin B18-28 (10мкг) при введении их внутрижелудочково достоверно не влияли на нахождение животного в отсеке. При введении SB-408124 (10мкг, в/ж) совместно с фенамином (1мг/кг, в/б) время нахождения в отсеке с введением препаратов, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижалось с 424,6с до 318с, а число переходов из отсека в отсек увеличилось с 7 до 8. При введении Orexin B18-28 (10мкг, в/ж) совместно с фенамином (1мг/кг, в/б) время нахождения в отсеке с введением препаратов, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижалось с 424,6с до 324с, а число переходов из отсека в отсек увеличилось так же с 7 до 13.
Табл. 7. Эффекты антагонистов орексина (10мкг/мкл) на фоне фенамина в реакции условного предпочтения места (влияние на экспрессию выработанного предпочтения места)
Препарат
Время в отсеке без введения препаратов (с.)
Время в отсеке с в введением препаратов (с.)
Число переходов из отсека в отсек
Фенамин1мг/кг, в/б
175,4 ± 44
424,6±44*
7±2
SB-408124 10мкг/мкл, в/ж+ 1мл физ. р-ра, в/б
294±8
306±7
8±3
SB-408124 10мкг/мкл, в/ж+ фенамин1мг/кг, в/б
264±21
336±23
11±4
Orexin B18-28 10мкг/мкл, в/ж +1мл физ.р-ра , в/б
299±11
301±9
10±2
Orexin B18-28 10мкг/мкл, в/ж+ фенамин1мг/кг, в/б
242±15
358±14
7±3
В опытах с влиянием препаратов на экспрессию выработанного предпочтения места SB-408124 (10мкг) и Orexin B18-28 (10мкг) при введении их внутрижелудочково достоверно не влияли на нахождение животного в отсеке. При введении SB-408124 (10мкг, в/ж) совместно с фенамином (1мг/кг, в/б) время нахождения в отсеке с введением препаратов, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижалось с 424,6с до 336с, а число переходов из отсека в отсек увеличилось с 7 до 11. При введении Orexin B18-28 (10мкг, в/ж) совместно с фенамином (1мг/кг, в/б) время нахождения в отсеке с введением препаратов, относительно показателей фенамина (1мг/кг, в/б), снижалось с 424,6с до 358с, а число переходов из отсека в отсек не изменялось.
Табл. 8. Эффекты антагонистов орексина (0,1мкг/мкл) на фоне фенамина в реакции условного предпочтения места (влияние на выработку предпочтения места)
Препарат
Время в отсеке без введения препаратов (с.)
Время в отсеке с в введением препаратов (с.)
Число переходов из отсека в отсек
Фенамин1мг/кг, в/б
175,4 ± 44
424,6±44*
7±2
SB-408124 0,1мкг/мкл, в/ж+ 1мл физ. р-ра, в/б